Tipizzazione molecolare di isolati di Salmonella Blockley multiresistenti isolati da un focolaio umano

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Numero 20 - giugno/luglio 2003

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Tipizzazione molecolare di isolati di Salmonella Blockley multiresistenti isolati da un focolaio umano

Fisichella S., Scuota S., Staffolani M., Zicavo A.

INTRODUZIONE
Salmonella Blockley è un sierotipo della specie Salmonella enterica con formula antigenica O: 6,8; H1: k; H2: 1,5.
Si tratta di un sierotipo non ospite specifico, per cui è possibile isolarlo da fonti umane, animali, alimentari e ambientali.

Una caratteristica di questo sierotipo è la spiccata multiresistenza agli antibiotici.
Il sierotipo Blockley occupa infatti la seconda posizione dopo Typhimurium nella graduatoria mondiale dei ceppi multiresistenti, e inoltre presenta un profilo di resistenza che include antibiotici specifici e poco rappresentati nei due sierotipi più diffusi (S. Typhimurium e S. Enteritidis).

La sua diffusione è diversa nelle varie parti del mondo: in Giappone, Malaysia e Tailandia, nella seconda metè degli anni '90 era tra i 5 sierotipi più frequentemente isolati sia in campo umano sia animale.
In Europa, particolarmente in Germania, Inghilterra, Galles e Grecia, a partire dalla seconda metè del 1998, è stato registrato un aumento lieve ma significativo dei casi umani di Salmonellosi sostenuti da questo sierotipo (4).

Tali informazioni si evincono dai rapporti annuali elaborati in ambito del circuito europeo di sorveglianza degli enterobatteri ENTERNET.
In Italia un primo episodio è collegato ad una epidemia avvenuta in Germania e connessa al consumo di anguille affumicate allevate in Veneto (2).

Dal 1999 al 2002 l'ISS ha registrato un aumento costante del numero degli isolamenti da fonti umane e non umane: si è passati da 169 casi notificati nel 1999 a 445 casi nel 2002; attualmente Salmonella Blockley è il quinto sierotipo più frequentemente isolato da casi umani di Salmonellosi (1.6%).
Per quanto riguarda le regioni Umbria e Marche, la frequenza di isolamento non si è discostata particolarmente dalla media nazionale fino al settembre 2002, quando si è verificata un'epidemia sostenuta da questo sierotipo che è stata oggetto di studio nel presente lavoro.

L'evento epidemico si è svolto in due asili nido del Comune di Pesaro e ha coinvolto 12 bambini e 4 educatrici.
Tale epidemia si è caratterizzata per la notevole percentuale di casi di portatori sani: su 16 soggetti positivi solo 3 bambini hanno riportato i sintomi dell'infezione acuta.

Le ricerche di Salmonella, effettuate sugli alimenti consumati e sulle coprocolture degli operatori del servizio di ristorazione, hanno dato esito negativo per Salmonella Blockley.
I 16 ceppi relativi all'evento epidemico, sono stati confrontati con altri 36 ceppi di Salmonella Blockley isolati nelle regioni Marche ed Umbria tra il 1997 e il 2003 da varie fonti: 5 ceppi umani isolati da casi sporadici, 9 campioni di origine animale, 21 di origine alimentare e un campione di origine ambientale.

Scopo di questo studio è stato quello di confrontare i profili di antibiotico-resistenza e i pulsotipi ottenuti dalla elettroforesi in campo pulsato (PFGE), per mettere in evidenza eventuali associazioni e valutare il potere discriminante delle due tecniche.

MATERIALI E METODI
La sierotipizzazione è stata eseguita tramite antisieri del commercio (Biogenetics).

L'antibiogramma è stato eseguito analizzando la serie di 16 antibiotici prevista dal protocollo ENTERNET-VET, mediante la tecnica di Kirby Bauer.

nal	Acido nalidixico 30 痢	amc	Amoxicillina + ac. Clavulanico 30 痢	amp	Ampicillina 10 痢
kf	Cefalotina 30 痢	ctx	Cefotaxime 30 µg	cip	Ciprofloxacina 5 痢
clo	Cloramfenicolo 30 痢	enr	Enrofloxacina 5 痢	gm	Gentamicina 15 痢
kan	Kanamicina 30 痢	neo	Neomicina 30 痢	str	Streptomicina 10 痢
sxt	Sulphamethoxazolo Trimethoprim 25 痢	s-3	Sulfonamide 300 痢	tet	Tetraciclina 30 痢

Le principali tecniche molecolari per la caratterizzazione del sierotipo Blockley sono la tecnica del profilo plasmidico e la PFGE (1).
Questa è stata eseguita secondo il protocollo PULS-NET previsto dal circuito europeo ENTERNET, che prevede l'uso dell'enzima di restrizione XbaI.

Per l'interpretazione dei dati sono state seguite le linee guida proposte da Tenover F.C. et al. (3).

RISULTATI
Il profilo di antibiotico-resistenza dei 16 ceppi umani isolati nel corso dell'epidemia è risultato sempre nal.kan.str.tet.neo; il numero di resistenze riscontrato nei casi sporadici è comunque più basso (0-4 resistenze), pur presentando in comune con i ceppi epidemici la resistenza per tetraciclina e streptomicina. La distribuzione delle resistenze nei ceppi isolati da animali e da alimenti è rappresentata rispettivamente nelle Tabelle 1 e 2

Tab. 1		Numero resistenze
Specie	n. ceppi	1-3	4 o più
Polli e tacchini	6	1	5
Volatili	2	--	2
Ovini	1	--	1
Totale	9	1(11.11%)	8(88.88%)

Tab. 2		Numero resistenze
Alimento	n. ceppi	1-3	4	5	6	7-8
Carne pollo	8	1	1	5	--	1
Carne tacchino	5	--	--	3	2	--
Carne bovina	7	--	--	3	3	1
Uova	1	--	--	--	--	--
Totale	21	2 (9.52%)	1 (4.76%)	11 (52.38%)	5 (23.81%)	2 (9.52%)

Tra gli isolati di origine animale e alimentare si osserva circa il 90% di ceppi multiresistenti (più di 4 resistenze) e i profili degli antibiotici risultano abbastanza vari, pur essendo sempre presente la resistenza a kan e neo; l'80% dei ceppi è resistente a nal, tet e str e il 61% è resistente a clo.
Il ceppo di origine ambientale presenta il profilo di resistenza nal.clo.kan.str.tet.neo, abbastanza simile a quello riscontrato nel ceppo epidemico e in numerosi ceppi di origine alimentare.

I risultati della PFGE confermano quanto giè dimostrato dagli autori greci (1); dal punto di vista genomico il sierotipo Salmonella Blockley risulta notevolmente omogeneo, tanto da poter affermare che si tratta di un sierotipo "monoclonale".
Questo fenomeno è riscontrabile anche in altri sierotipi come Salmonella Infantis e Salmonella Bredeney; in Salmonella Derby e nei sierotipi endemici Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium si osserva invece un'ampia variabilitè genomica.

Infatti, come riportato nella figura 1, anche confrontando ceppi isolati da 4 fonti diverse, senza alcuna correlazione temporale e geografica, si ottengono pulsotipi che differiscono al massimo per 2 frammenti e che quindi si possono includere nella categoria dei ceppi "strettamente correlati" (3).
Nella figura 2 sono rappresentati i pulsotipi di 11 campioni isolati nel corso della epidemia: i profili ottenuti dai ceppi epidemici risultano perfettamente sovrapponibili a quelli dei ceppi sporadici riportati in figura 1.

Emerge quindi una notevole omogeneitè genomica in contrasto con una discreta variabilitè nel profilo di antibiotico resistenza.

CONCLUSIONI

L'antibiogramma risulta più efficace della PFGE nel discriminare vari ceppi di S. Blockley; trattandosi comunque di un metodo che valuta una caratteristica fenotipica, sembra più corretto utilizzare le due metodiche in maniera complementare, piuttosto che comparativa.
Per aumentare il potere discriminante della PFGE, sarebbe opportuno utilizzare enzimi diversi da XbaI, oppure adottare tecniche molecolari alternative come la RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA), la definizione del profilo plasmidico e la ricerca del plasmide di virulenza nei ceppi che hanno causato infezione acuta.

La nuova Direttiva in materia di zoonosi proposta dalla UE, che dovrè sostituire l'attuale Direttiva 92/117/CEE, sottolinea l'importanza del monitoraggio di tutti i sierotipi rilevanti per la Sanitè Pubblica, a differenza della Direttiva vigente che prende in considerazione solo i sierotipi S. Typhimurium e S. Enteritidis.
Il sierotipo Blockley sembra possedere tutti i requisiti per essere incluso tra i sierotipi rilevanti per la sanitè pubblica.

RINGRAZIAMENTI
Si ringraziano per la gentile collaborazione tecnico-scientifica gli operatori del Centro Nazionale di Referenza per le Salmonellosi animali dell'IZS delle Venezie, e in particolare la Dr.ssa Antonia Ricci, la Dr.ssa M.Cristina Della Pozza, la Dr.ssa Letizia Ceglie e Paola Zavagnin. Si ringrazia inoltre la Dott.ssa Ida Luzzi dell'ISS per la preziosa consulenza.

BIBLIOGRAFIA

1. Tassios P. et al. "Molecular typing of Multidrug-Resistent Salmonella Blockley Outbreak Isolates from Greece". Emerg. Infect. Dis. 2000. 6 (1), 60-64.
2. Fell G. et al "An outbreak of Salmonella Blockley infections following smoked eel consumption in Germany" Epidemiol. Infect. 2000. 125, 9-12.
3. Tenover F.C. et al. "Interpreting chromosomal DNA Restriction Patterns Produced by Pulsed-Field Gel Electrophoresis: Criteria for Bacterial Strain Typing" J. Clin. Microbiol. 1995; 33(9), 2233-2239.
4. Eurosurveillance. 1998. 2(39).

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