Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 100, Febbraio 2017 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
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Allergeni Alimentari: approccio biomolecolare per la rilevazione di soia e arachide
Food Allergens: biomolecular approach for peanut and soybean detection

Elisa Pierboni, Martina Torricelli, Gloria Raquel Tovo, Cristina Rondini


Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche. Perugia


Abstract. Food allergies are a growing health concern, also with severe reactions, which negatively affect health-related quality of life. The only precautionary measure against food allergy reactions is avoidance of the trigger food, therefore checking ingredients details becomes the mainstay in making an informed choice. Legal requirements about most common allergens labelling or information provisions have been established in Europe and other developed countries. Nevertheless, RASFF notifications related to undeclared allergens in food products have increased in recent years. The difficulties to assure reliable food allergens control are associated with the lack of reference methods, reference materials and regulatory thresholds. Thus, food allergens detection relies on the different sensitivity of analytical methods often not validated. The purpose of this study is to assess the reliability of PCR-based screening methods for peanut and soybean detection, in order to reduce risks posed by food that may contain these ingredients that are two of the major vegetable allergens

Riassunto. L'allergia alimentare è una patologia sempre più diffusa, con una sintomatologia anche grave e limitante la qualità della vita del soggetto allergico. Per tenere sotto controllo le allergie alimentari l'unico trattamento profilattico, è il non consumo dell'alimento coinvolto, pertanto la lista degli ingredienti diventa l'unico mezzo per attuare una scelta informata e consapevole. In Europa e in altri paesi industrializzati si è quindi ritenuto necessario emanare leggi e regolamenti per l'etichettatura delle maggiori sostanze allergeniche. Nonostante ciò, il sistema RASFF ha evidenziato un aumento di notifiche per prodotti contenenti allergeni non dichiarati in etichetta. La difficoltà nel garantire il corretto controllo di allergeni alimentari è spesso legata alla carenza di metodi analitici validati, di materiali di riferimento certificati e di definizione di livelli soglia. Pertanto la rilevazione di allergeni è spesso affidata alla sensibilità dei metodi in uso, spesso non validati. Questo studio vuole verificare e proporre metodi biomolecolari validati per la rilevazione di arachide e soia, utili come metodo di screening per ridurre il rischio di contaminazione dei prodotti alimentari causato da due dei maggiori allergeni vegetali


Introduzione
L'allergia alimentare rientra tra le Reazioni Avverse al cibo che si dividono in reazioni tossiche e non tossiche (Boyce et al., 2010). Le reazioni avverse di tipo tossico, si manifestano in seguito all'assunzione di cibo contaminato da microrganismi patogeni e sostanze xenobiotiche e dipendono dalla dose presente, verso la quale sono suscettibili tutti gli individui. Le reazioni avverse di tipo non tossico dipendono dalla suscettibilità individuale, riguardano quindi solo alcuni individui della popolazione, affetti da ipersensibilità alimentare.
Le ipersensibilità alimentari, sono suddivise in base ai meccanismi patogenetici in "Allergiche" e "Non allergiche" (EAACI-Accademia Europea di Allergologia e Immunologia Clinica).

Le ipersensibilità alimentari "allergiche", dovute a reazioni immunomediate, vengono definite Allergie Alimentari (AA): un'anormale risposta immunologica avversa al cibo, solitamente ad una proteina presente naturalmente. Le AA si suddividono in reazioni IgE-mediate, come ad esempio l'allergia all'arachide e NON-IgE mediate, come la celiachia, che è un'enteropatia immuno-mediata, con coinvolgimento dei linfociti T (Ludvigsson et al., 2013).
Le ipersensibilità alimentari "non allergiche", non comportano una anormale risposta del sistema immunitario e vengono definite Intolleranze Alimentari, per le quali sono riconosciute tre diverse forme. Le reazioni non-immunomediate di tipo: 1. enzimatico, dovute alla carenza o assenza di un enzima, come nell'intolleranza al lattosio; 2. farmacologico, come nel caso dell'intolleranza all'istamina, da non confondere con la sindrome sgombroide, causata da livelli di istamina molto superiori a quelli capaci di causare intolleranza in soggetti suscettibili; 3. idiosincratico, come asma indotta da solfiti, attraverso meccanismi ancora non ben compresi (Taylor et al., 2005).

Tra le ipersensibilità alimentari, la sintomatologia clinica può variare ampiamente, dal leggero malessere gastrointestinale, rush cutanei, asma fino allo shock anafilattico, dipendente dalla diversa sensibilità individuale, circostanza, stato di salute e allergene coinvolto. La reazione è tanto più grave quanto più rapida è la sintomatologia che determina e le AA sono quelle che presentano le reazioni più importanti dal punto di vista clinico. In particolare, le reazioni IgE-mediate verso proteine termo e gastro resistenti, sono quelle coinvolte nelle reazioni più severe, in quanto non riguardano soltanto l'apparato direttamente in contatto con l'alimento, cioè il tratto gastrointestinale e in particolare la bocca, ma possono interessare anche l'apparato tegumentario, l'apparato respiratorio, l'apparato circolatorio e il sistema nervoso centrale, l'interessamento sistemico è quello che determina reazioni gravi come lo shock anafilattico.

Le AA sono associate ai Paesi industrializzati con insorgenza in età pediatrica e spesso regressione in fase di crescita, oppure in età adulta con persistenza per tutta la vita, associate spesso a ipersensibilità a più di un allergene. L'incidenza delle AA ha un importante impatto sui costi dei servizi sanitari, sul soggetto allergico e suoi familiari e conseguente peggioramento della qualità della vita. L'AA è una patologia che ha richiamato l'attenzione negli ultimi anni, per il numero sempre maggiore di soggetti allergici, si stima che coinvolga 220 milioni di persone nel mondo (Manea et al. 2016).
Per tenere sotto controllo le allergie l'unico trattamento profilattico, è il non consumo dell'alimento responsabile, realizzabile grazie ad una completa ed accurata informazione sulle sostanze contenute nel cibo, ottenuta tramite l'etichettatura dei cibi.

Legislazione
Diversi Paesi nel mondo hanno riconosciuto l'importanza di riportare la presenza di diversi ingredienti responsabili di allergie, mediante l'emanazione di leggi e regolamenti per l'etichettatura obbligatoria. I regolamenti per l'etichettatura degli allergeni differisce significativamente nel mondo, in base a diversi criteri sono stati infatti identificati gli allergeni più importanti (Gendel S.M., 2012). All'interno delle 20 liste, mostrate nella Figura 1, è possibile visionare gli allergeni che devono essere obbligatoriamente indicati in etichetta per ogni singolo Paese e quindi le differenze, che portano a rilevare solo quattro allergeni presenti in tutte le liste, ovvero crostacei, latte, uova e arachide.
Figura 1. Allergeni regolamentati per l'etichettatura in diversi Paesi del mondo
Figura 1. Allergeni regolamentati per l'etichettatura, in diversi Paesi del mondo
Figure 1. Allergen food labelling, in different world Countries

Source: FARRP-Food Allergy Research and Resource Program http://farrp.unl.edu/reg-sit-food-allergens


In particolare, nell'Unione Europea è attualmente vigente il Regolamento (UE) N. 1169/2011, che prevede disposizioni importanti per quanto riguarda gli allergeni. Ovvero, impone di indicare in etichetta le sostanze che provocano allergie e intolleranze (allegato II) usate come ingredienti nel prodotto alimentare (art.9) e di metterle in evidenza tra gli ingredienti, ad esempio con il colore o lo stile dei caratteri di scrittura, ecc. (art. 21). Inoltre l'obbligatorietà vale anche per i prodotti NON preimballati (art.44), somministrati ad esempio nei ristoranti o nelle panetterie.

Tabella 1. Elenco delle sostanze o prodotti che devono essere indicate in etichetta in base all'allegato II del Regolamento (UE) N. 1169/2011
Table 1. List of substances or products to be indicated on the label according to Regulation (EU) No 1169/2011, Annex II


Il Regolamento (UE) N. 1169/2011 individua gli allergeni presenti nel cibo come ingredienti, ma essi potrebbero essere presenti come allergeni nascosti, ovvero componenti inattesi, presenti nel prodotto finale, ma non dichiarati in etichetta, per cause quali errori di formulazione, di confezionamento, contaminazione accidentale nel trasporto, stoccaggio e produzione.
Ciò ha portato le industrie, onde evitare rischi, all'adozione di una etichettatura precauzionale volontaria o PAL (Precautionary Allergen Labelling), argomentata nell'articolo 36, del Regolamento (UE) N. 1169/2011, che si traduce con varie diciture come "può contenere…". Nonostante ciò i richiami dovuti alla mancata indicazione in etichetta degli allergeni negli alimenti è in aumento, come si può vedere dalle notifiche RASFF - Rapid Alert System for Food and Feed (Figura 2).

Figura 2. Numero di notifiche RASFF, suddivise per anno dovute al ritiro di prodotti non riportanti in etichetta la presenza di allergeni
Figure 2. RASFF alert notifications 2008-2015, related to the finding of food allergens not declared on product label
Source: RASFF Food and Feed Safety Alerts - European Commission


Il fatto che l'etichettatura precauzionale sia volontaria, porta da un lato all'indicazione della presenza di allergeni nascosti anche se assenti nel prodotto, dall'altro lato alla mancata segnalazione di allergeni nascosti in prodotti che effettivamente li contengono. Ne deriva una crescente frustrazione nei consumatori allergici, che sono ulteriormente limitati nella loro possibilità di acquisto e consumo di alimenti sicuri, che si traduce in una reale difficoltà nel fare una scelta informata, con aumento di ansia, costi e peggioramento della qualità della vita (DunnGalvin et al. 2015). Sarebbe quindi utile conoscere la dose capace di provocare allergia, parametro su cui basare le regole di etichettatura degli allergeni, per aiutare nella valutazione e nella gestione del rischio.
Per rispondere a queste mancanze sono in corso studi in Australia/Nuova Zelanda in collaborazione con il FARRP e altri Paesi del mondo, dove è stato sviluppato il Programma VITAL (Voluntary Incidental Trace Allergen Labeling) per aiutare i produttori di alimenti nella gestione delle cross-contaminazioni durante le fasi di produzione e per individuare dei limiti soglia già proposti per molti di essi (Allen et al. 2014; Taylor et al. 2014), che per ora non sono stati universalmente riconosciuti.

Determinazione analitica degli allergeni negli alimenti
I principali metodi analitici disponibili per la rilevazione e quantificazione di allergeni includono ELISA, PCR e metodologie basate sulla spettrometria di massa (MS), basati sulla rilevazione di proteine o DNA, ciascuno con vantaggi e svantaggi che possono portare a risultati falsi positivi o falsi negativi. L'ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assays) è l'approccio analitico più diffuso, ma non il solo metodo immunoenzimatico utilizzato (Dipstick Assay/Lateral Flow Device - LFD; biosensori/Lab on chip; Fluorescence Polarisation). Il metodo si basa sulla rilevazione della proteina allergenica, è facile, veloce, ma presenta poca riproducibilità, in quanto non tutti i kit in commercio sono validati, inoltre presenta problemi di cross-reattività, e subisce effetto matrice.
La PCR (Polymerase chain reaction) è uno dei metodi più utilizzati tra quelli basati sul DNA, come approccio indiretto (PCR+ gel elettroforesi; real-time PCR; biosensori/Lab on chip). La PCR è un metodo altamente specifico, molto sensibile, rapido nella risposta, anche se presenta un'estrazione del DNA più complessa rispetto a quella delle proteine prevista nei metodi immunoenzimatici, è meno soggetta agli effetti di processo e matrice in quanto il DNA è relativamente stabile, ma il contenuto stimato non è correlabile al contenuto proteico. La MS è una tecnica in grado di rilevare proteine e peptidi, specifica e sensibile, però non esistono ancora protocolli di riferimento, richiede personale specializzato e strumentazione costosa. Viste le elevate potenzialità della spettrometria di massa, sta ricevendo molta attenzione come metodo di conferma per l'analisi di allergeni alimentari.

Le maggiori problematiche riguardano la mancanza di protocolli analitici qualitativi e quantitativi affidabili e riproducibili per i principali allergeni alimentari, dovuta sia alla carenza di materiali di riferimento certificati e metodi ufficiali, sia alla difficoltà di determinare proteine processate, nonché alla variabilità dell'espressione del risultato analitico (la PCR espressa in n° di copie, i metodi immunoenzimatici espressi in proteine solubili o peptidi o proteine totali) che rende difficoltoso un paragone tra i metodi disponibili.
A questo proposito l'associazione MoniQA (Monitoring and Quality Assurance in the Total food Supply Chain), con sede in Austria, ha tra le proprie finalità quella di fornire linee guida per la validazione dei metodi e la valutazione dell'affidabilità attraverso studi di validazione, inoltre sta sviluppando metodi per l'analisi di allergeni in spettrometria di massa. Altro obiettivo è quello di rendere disponibili materiali di riferimento certificati, finalità raggiunta per la matrice latte, in commercio da gennaio 2017, mentre sono in preparazione i materiali relativi agli allergeni glutine, uova e soia. Inoltre con il Progetto Europeo iFAAM, sono riusciti a mettere a punto uno strumento per l'industria alimentare come parte di uno schema integrato e incluso nell'HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point) basato su modelli statistici con approccio probabilistico, utile nella gestione del rischio.

Ricerca Corrente
In base a quanto argomentato, le allergie alimentari sono una patologia attualmente diffusa, con una sintomatologia anche grave, quindi pericolosa e limitante la qualità della vita del soggetto allergico. Sono quindi necessarie sia una gestione del rischio da parte dei produttori di alimenti (Regolamento (CE) N. 178/2002) che una verifica da parte dei laboratori per assicurare la conformità di etichettatura e garantire quindi la tutela del consumatore allergico (Regolamento (UE) N.1169/2011).
Il controllo di allergeni nel cibo, in termini di presenza/assenza è per ora affidato alla sensibilità dei metodi in uso, spesso non validati. I metodi analitici disponibili presentano vantaggi e svantaggi, l'obiettivo sarebbe individuare il metodo migliore per la rilevazione di ogni allergene indicato nell'allegato II del Regolamento (UE) N.1169/2011, così come è accaduto nel caso del latte, uova e sedano. Infatti per la rilevazione di latte e uova, occorre utilizzare un metodo immunoenzimatico, in quanto in PCR non sarebbe possibile trovare un marker specifico che non amplifichi il DNA di bovino e pollo rispettivamente; per la rilevazione di sedano, invece, il metodo di riferimento è basato sul rilevamento del DNA in PCR (UNI CEN/TS 15634-2: 2012) a causa della reattività crociata, nei metodi immunoenzimatici, di proteine appartenenti a molte altre piante commestibili della stessa famiglia.

L'obiettivo della Ricerca Corrente 2014, Progetto IZSUM 07/14 RC è pertanto quello di individuare quale metodo tra ELISA e PCR, si presti meglio allo screening di due allergeni di origine vegetale, soia e arachide e due allergeni di origine animale, pesce e crostacei, svolto da altre unità operative. Altra finalità è la valutazione e/o la messa a punto di metodi quantitativi, in attesa che vengano fissati dei livelli soglia di riferimento per ogni singolo allergene come già avvenuto per il glutine (Regolamento (UE) N. 828/2014). Nell'ambito del progetto, il lavoro finora svolto dall'unità operativa dedicata alla messa a punto e valutazione di metodi in PCR real-time per la rilevazione e quantificazione degli allergeni soia e arachide è di seguito descritto.

Estrazione
Il primo obiettivo è stato quello di individuare un metodo di estrazione utile ad ottenere DNA di qualità e quantità idonea per essere sottoposto alle successive analisi in PCR real-time, che fosse pratico ed efficiente in varie matrici alimentari.
Dalla bibliografia sono stati valutati i metodi maggiormente testati per le matrici soia ed arachide, quelli già confrontati e valutati e sono stati quindi scelti due metodi di estrazione che risultavano più efficienti, indagando anche i punti che erano carenti in bibliografia, per ottenere un quadro completo e chiaro al fine di una scelta ottimale.

Sono stati testati due metodi di estrazione, basati su due diversi buffer di estrazione (CTAB - UNI EN ISO 21571:2013 e guanidina idrocloruro - Germini et al. 2005) ognuno combinato a quattro kit di purificazione, su entrambe le matrici considerate e su quantità di materiale di partenza di 1 g e 2 g (farina di soia e arachidi tostate polverizzate) (Tabella 2).
I kit commerciali utilizzati per la purificazione del DNA estratto, sono stati:


Ogni metodo di estrazione e purificazione è stato testato in doppio, per un totale di 64 prove, 32 per arachide e 32 per soia.

Tabella 2. Schema delle prove di estrazione del DNA da soia e arachide associate a quattro metodi di purificazione testati su due diversi quantitativi di materiale di partenza
Table 2. DNA extraction from soy and peanut associated with four purification methods tested on two different quantities of material


La verifica di due differenti quantitativi di materiale di partenza è servito per valutare quale tra questi fosse il più ripetibile e rappresentativo, soprattutto nell'ottica di ricercare target presenti in tracce come nel caso degli allergeni nascosti. Due materiali di riferimento non certificati, RM800 e Allergen40, contenenti soia e arachide in quantità diverse oltre ad altri allergeni, forniti rispettivamente con i kit di estrazione Biotecon e R-Biopharm, sono stati testati con i metodi di estrazione e purificazione selezionati e con i rispettivi kit.

Tabella 3. Schema relativo alle prove di estrazione eseguite sui materiali di riferimento non certificati Allergen40 (R-Biopharm) e RM800 (Biotecon)
Table 3. DNA extraction performed on non-certified reference materials Allergen40 (R-Biopharm) and RM800 (Biotecon)


Tutti i DNA estratti sono stati valutati mediante test d'inibizione in PCR real-time (Fast Monitor Run) per il gene pianta generico, actina (Torricelli et al. 2016).
Tra i metodi testati è stato scelto quello più efficiente in termini di quantità e qualità di DNA estratto, per entrambe le matrici soia e arachide, e successivamente validato.
La validazione ha previsto, per ogni matrice, l'estrazione di 6 campioni uguali, in tre giorni differenti, ottenendo per ognuna 18 DNA, testati per valutare parametri di quantità, qualità, ripetibilità, riproducibilità (EUR 24790EN 2011, MPR 2015). Il metodo selezionato ha risposto ai requisiti di validazione, mostrandosi idoneo per l'estrazione di soia e arachide.

Fast PCR real-time
Altro obiettivo della ricerca è stato quello di individuare il miglior sistema genico per rilevare soia e arachide, da ottimizzare in fast PCR real-time, modalità che consente una riduzione dei tempi analitici rispetto a quella più ampiamente utilizzata e diffusa conosciuta come modalità standard. La ricerca bibliografica ha indirizzato alla scelta di 2 geni per l'arachide codificanti per le maggiori proteine allergeniche: Arah1 e Arah2. Per il gene Arah1 è stata individuata, tramite bibliografia, la sequenza utilizzata per costruire, mediante l'impiego di Primer Express v.3.0, due set di oligonucleotidi (primer e probe), con una sonda marcata al quencher con TAMRA e l'altra con MGB-NFQ. Per il gene Arah2, è stato adottato un metodo presente in bibliografia (Hird et al. 2003) e costruito un nuovo sistema con la sonda marcata al 3' in MGB-NFQ. Per la soia sono stati scelti 2 geni, Glym30 e Glym5. Il gene Glym5, per ora mai utilizzato allo scopo, la cui sequenza è stata utilizzata per costruire un sistema primer/probe, marcato al quencher con MGB-NFQ. L'altro gene selezionato è stato GlymBd30K, per il quale abbiamo adottato il metodo presente in bibliografia (Platteau et al. 2011) ed inoltre sulla sequenza nucleotidica è stato studiato un nuovo sistema con sonda marcata al 3' in MGB-NFQ. I metodi selezionati sono stati testati in fast PCR real-time per l'ottimizzazione delle concentrazioni di primer e probe. Il test ha previsto la verifica di tre diverse concentrazioni di primer forward e reverse, combinate tra loro per un totale di 9 combinazioni per ogni sistema di PCR, testate ognuna in quadruplice copia. I risultati di ogni sistema di PCR sono illustrati nella Tabella 4 per arachide e nella Tabella 5 per soia.
Tabella 4. Le migliori concentrazioni di primer e probe dei sistemi selezionati per la rilevazione di arachide
Table 4. The best primer and probe concentrations of selected systems for peanut detection


Tabella 5. Le migliori concentrazioni di primer e probe dei sistemi selezionati per la rilevazione di soia
Tabella 5. The best primer and probe concentrations of selected systems for soybean detection


Ottenute le concentrazioni di primer e probe alle quali ogni sistema funziona con la massima efficienza, si è proceduto alla valutazione dei parametri qualitativi di specificità, sensibilità o LOD e robustezza (MPR 2015).

Specificità
La specificità è stata testata contro DNA estratti da 70 prodotti costituiti da spezie, frutta, frutta secca, cereali, legumi, tuberi, verdura, animali. Tali DNA verificati qualitativamente e quantitativamente, sono stati preparati allo stesso Cq di uscita per il gene actina, al fine di testare la stessa quantità di ogni prodotto con ogni sistema di PCR. Si è ottenuto il 100% di specificità per i quattro sistemi di arachide e per i 3 sistemi di soia selezionati, in quanto si è avuta amplificazione solamente verso i target specifici, rispettivamente di arachide e soia.

Sensibilità
Per testare la sensibilità o LOD (Limit Of Detection), i quattro sistemi di arachide e i tre di soia sono stati testati ognuno, contro 12 concentrazioni di DNA in ng/µL decrescenti (6 replicati in 3 sessioni di lavoro svolte in giorni diversi). L'ultima diluizione in cui si sono ottenute il 100% di amplificazioni, definita come LOD6, è stata testata in 60 replicati (LOD95), con verifica della diluizione a monte e/o a valle. E' stato individuato il metodo più sensibile per ciascuna delle due matrici, da utilizzare nell'identificazione degli allergeni arachide e soia.

Robustezza
La robustezza è stata testata su tutti i sistemi per arachide e per soia. E' stata verificata applicando delle variazioni deliberate alla concentrazione di master mix, dei primer e della probe, al volume di reazione e alla temperatura di annealing, secondo quanto definito in Pierboni et al. 2016.
Tutti i sistemi di arachide e soia si sono mostrati robusti, avendo ottenuto una concordanza del 100% degli amplificati rispetto al metodo di riferimento privo di variazioni. Pertanto tutti i metodi testati si sono mostrati affidabili.

Campioni commerciali
Per valutare l'applicabilità dei metodi selezionati per arachide sono stati testati dei campioni reali prelevati al dettaglio, mentre per la soia, questo test verrà effettuato successivamente.
Sono stati scelti: 5 prodotti che non contenevano arachide tra gli ingredienti, ma ne veniva riportata la presenza nell'etichetta precauzionale volontaria; 5 prodotti che non contenevano arachide né tra gli ingredienti, né nell'etichetta precauzionale volontaria; 5 prodotti che dichiaravano la presenza di arachide in etichetta.

I DNA estratti dalle varie matrici alimentari, come biscotti, barrette di cereali, preparati già pronti, snack dolci e salati, burro di arachide, sono stati verificati e valutati idonei tramite il gene actina tranne un campione di salsa per noodles in quanto non si rilevava la presenza di DNA vegetale (actina). I DNA sono stati verificati con i quattro sistemi dello studio, che con sensibilità diversa hanno mostrato amplificazione solo per i prodotti contenenti arachide in etichetta.

Conclusioni
I metodi biomolecolari testati e validati si sono dimostrati rapidi, sensibili, specifici e affidabili. L'estrazione del DNA è abbastanza complessa, rispetto a quella delle proteine prevista per i metodi immunoenzimatici, ma si è rilevata efficiente su varie matrici alimentari come biscotti, snack dolci e salati, burro d'arachide, quindi utilizzabile come metodo di screening per gli allergeni soia e arachide.
Questi metodi potrebbero quindi essere utili nella rilevazione di allergeni nascosti a tutela del consumatore allergico per il quale il controllo dietetico-analitico è fondamentale.
Il nostro studio ci permetterà di proporre metodi biomolecolari validati per gli allergeni soia e arachide, contribuendo a fornire ulteriori informazioni nella scelta di metodi di riferimento ancora in via di definizione.



Ringraziamenti
Si ringrazia il Ministero della Salute che ha finanziato il Progetto IZSUM 07/2014 RC "Studio e controllo degli allergeni negli alimenti: valutazione e messa a punto di un metodo di conferma biomolecolare", Responsabile Scientifico Dott. Naceur Haouet.



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Sitografia

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FARE, Food Allergy Research & Education - https://www.foodallergy.org/facts-and-stats

FARRP, Food Allergy Research and Resource Program - http://farrp.unl.edu/reg-sit-food-allergens

MONIQA, International Association for Monitoring and Quality Assurance in the Total Food Supply Chain - http://www.moniqa.org/

VITAL, Allergen Bureau | - http://allergenbureau.net/vital/


OPEN REVIEW - Modulo per la "revisione aperta" di questo articolo, pubblicato sul numero 100/2017 di SPVet.it



Pierboni et al., 2017. Allergeni Alimentari: approccio biomolecolare per la rilevazione di soia e arachide (SPVet.it 100/2017)
Pierboni et al., 2017. Allergeni Alimentari: approccio biomolecolare per la rilevazione di soia e arachide (SPVet.it 100/2017)


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