Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 101, Aprile 2017 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
Documento reperibile all'indirizzo: http://spvet.it/indice-spv.html#658
Indagine sulla diffusione di ceppi enterotossigeni di stafilococchi coagulasi positivi ed in particolare di S. aureus nella filiera lattiero casearia marchigiana
Investigation on the spread in the dairy chain of Marche Region (Italy) of positive coagulase enterotoxigenic staphylococci strains and particularly S. aureus
Fabrizia Guidi1, Fabio Zuccon2, Angelo Romano2, Simonetta Ruggeri3, Caterina Pennesi4, Carlo Belardinelli4, Stefano Fisichella1,
Annalisa Petruzzelli1, Andrea Valiani1, Laura Medici1, Manuela Lanciotti1, Gianluca Striano1, Barbara Palombo1, Giuliana Blasi1
1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche;
2 Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d'Aosta - LNR per stafilococchi coagulasi positivi compreso S.aureus;
3 ASUR Marche - Area Vasta n. 4, Fermo -SIAOA;
4 ASUR Marche - Area Vasta n. 3, Macerata - Camerino - SIAOA.
Abstract. Staphylococcus aureus, due to its capability to produce and release heat-stable enterotoxins (Staphylococcal Enterotoxins-SEs) in a wide range of foods, is one of the most common agents in bacterial food poisonings outbreaks. Milk and dairy products are frequently contaminated with enterotoxigenic S. aureus, carried by human handlers or by the udder and teat skin of dairy mastitic animals.
The aim of this study is to investigate the spread of enterotoxigenic Coagulase Positive Staphylococci (CPS) and S. aureus, in milk and dairy products of Marche region (Italy) and to evaluate the presence of mecA e mupA genes encoding for Methicillin and Mupirocin resistance. In the biennium 2015-2016 14 farms were sampled and bulk tank milk, cheese, milk from automatic milk distributors and environmental samples were tested for the enumeration of CPS. The isolated strains were analyzed by three multiplex PCR targeting the16S rRNA (Staphylococcus genus specific), nuc (S. aureus specific), MecA, mupA and the SEs genes. In the 86% of the farms sampled CPS were found even above the regulatory limits. All the 144 isolated SCP strains were identified as S. aureus. No tested strains were positive for any of the resistance genes. Ninety-one S. aureus gave positive results for at least one of the SEs genes and 85 of them had genes for the classic SEs (A, B, C, D, E), for which the causality with food poisonings outbreaks is known
Riassunto. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di approfondire le conoscenze circa la diffusione di SCP e nello specifico di S. aureus, all'interno della filiera lattiero-casearia marchigiana valutando anche il potenziale enterotossigeno dei ceppi isolati e la presenza dei geni MecA e mupA, per la resistenza rispettivamente a Meticillina e Mupirocina. A tal fine nel biennio 2015-2016 è stato effettuato un piano di campionamento in 14 aziende selezionate delle provincie di Macerata e di Fermo. I campioni di latte di massa, formaggi, latte crudo vaccino da distributori automatici e tamponi ambientali sono stati analizzati per la numerazione di Stafilococchi Coagulasi Positivi (SCP) e i ceppi isolati sono stati identificati e caratterizzati mediante tre PCR multiplex. I target ricercati sono stati: il 16S rRNA (specifico per il genere Staphylococcus), nuc (spcifico per S. aureus), MecA e mupA e i geni codificanti per le enterotossine stafilococciche (SEs). L'86% delle aziende analizzate è risultato positivo per la presenza di SCP. I 144 ceppi isolati hanno dato tutti esito positivo per S. aureus e in nessuno di essi sono stati rilevati geni di resistenza. Novantuno ceppi sono risultati potenzialmente enterotossigeni e di questi 85 presentavano almeno un gene per le SEs principali (A, B, C, D ed E), per le quali è noto il coinvolgimento in casi di intossicazione alimentare
Introduzione
Staphylococcus aureus, comune commensale della cute dell'uomo e degli animali, è un batterio appartenente al gruppo degli Stafilococchi Coagulasi Positivi (SCP) in grado di causare infezioni opportunistiche di natura ed entità variabile (Fitzgerald et al 2012).
La sua capacità di sintetizzare e rilasciare negli alimenti delle enterotossine termostabili, unitamente con la sua estesa diffusione in varie categorie di alimenti, lo rende uno dei principali responsabili dell'insorgenza di malattie trasmesse da alimenti (MTA) e in particolare di intossicazioni alimentari note come intossicazioni da enterotossine stafilococciche (SEs) (Normanno et al. 2005; EFSA 2016).
Un altro aspetto importante legato a questo patogeno è la sua capacità di acquisire resistenze, anche multiple, verso i più comuni antibiotici impiegati sia in medicina umana che veterinaria. Una delle più diffuse è quella verso la Meticillina, il cui meccanismo è codificato dal gene MecA e che ha richiesto l'impiego di molecole alternative, quali la Mupirocina, per la cura delle infezioni da S. aureus resistenti (MRSA). La recente comparsa di ceppi resistenti anche nei confronti di questo secondo antibiotico, in virtù della presenza del gene mupA, sta destando particolare preoccupazione (Zhang et al 2004). La filiera lattiero-casearia, rilevante nell'economia marchigiana, è tra quelle principalmente coinvolte nella contaminazione da S. aureus, sia come conseguenza di forme mastitiche dell'animale, sia per una non adeguata applicazione delle buone prassi igieniche di lavorazione da parte delle maestranze che albergano il microrganismo sulla cute o a livello delle mucose respiratorie (Giacinti et al 2011).
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di approfondire le conoscenze circa la diffusione di SCP e nello specifico di S. aureus, all'interno della filiera lattiero-casearia marchigiana valutandone anche il potenziale enterotossigeno e la presenza di geni di resistenza MecA e mupA. A tal fine nel biennio 2015-2016 è stato effettuato un piano di campionamento esteso alle principali realtà territoriali in cui il comparto lattiero-caseario riveste una certa importanza.
Materiali e metodi
Campionamento e allestimento di una collezione batterica
Il campionamento è stato eseguito dai Servizi Veterinari dei Dipartimenti di Prevenzione dell'ASUR Marche competenti per territorio.
I criteri seguiti per la scelta delle aziende hanno tenuto conto dei seguenti fattori di rischio: episodi pregressi di intossicazione riconducibili a tossina stafilococcica, frequente rinvenimento di livelli di SCP al di sopra dei limiti normativi, produzione di formaggi al latte crudo o trattato con temperature inferiori a quella della pastorizzazione, utilizzo prevalente di latte della propria azienda, mancato utilizzo di colture starter, ambienti di trasformazione non controllati in termini di condizionamento, temperatura e umidità, autocontrollo ritenuto non adeguato ecc. Le matrici che hanno interessato il campionamento sono state: latte di massa, formaggi a 5-6 giorni dalla data di caseificazione, latte crudo vaccino da distributori automatici e tamponi su superfici ed attrezzature sanificate.
I prelievi sono stati eseguiti nei periodi gennaio-marzo e giugno-luglio, in aliquota unica in 5 unità campionarie (u.c.) nel caso dei formaggi, in aliquota unica in 1 u.c. nel caso di latte o semilavorati e in aliquota unica in 5 u.c. per il latte crudo vaccino destinato alla vendita diretta mediante distributore automatico.
Tutti i campioni sono stati trasportati in condizione di refrigerazione (+4° C) presso i laboratori dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale Umbria e Marche (Sezioni di Fermo e Macerata), dove sono stati analizzati entro le 24h successive. Su tutti la numerazione di SCP è stata effettuata in accordo con la UNI EN ISO 6888-2: 2004 per gli alimenti e con la ISO 18593: 2004 (esclusi capp. 6 e 7) + UNI EN ISO 6888-2: 2004 per i tamponi ambientali. La numerazione di S. aureus, invece è stata eseguita secondo un metodo interno accreditato basato sulla conferma, mediante il test di Voges-Proskauer (VP), di un numero significativo di colonie di SCP sospette per S. aureus, e sul successivo calcolo del numero di UFC di S. aureus per unità di misura.
Tutti i ceppi batterici riconducibili a S. aureus, isolati sono stati identificati con apposito codice numerico e conservati in MicrobankTM a - 20 °C e/o in glicerolo a -80°C. Per ogni campione risultato positivo per la presenza di SCP, è stato conservato almeno un ceppo per u.c.
La conformità dei campioni di formaggio è stata stabilita ai sensi del Reg.(CE) 2073/05 e s.m.i., mentre quella dei campioni di latte crudo da distributore automatico ai sensi del DDPF Veterinaria e Sicurezza Alimentare n.123/vsa_04 del 26/05/2008. Sulle aliquote considerate non conformi, è stata eseguita la determinazione delle enterotossine stafilococciche A, B, C, D ed E, mediante l'utilizzo del sistema automatizzato VIDAS® (bioMérieux) (Sezione di Pesaro).
Caratterizzazione molecolare degli isolati
Estrazione del DNA.
Per ogni ceppo di campo isolato e per i relativi ceppi di riferimento, il DNA batterico è stato estratto a partire da una sospensione batterica di 1-2 colonie in 100µL di una soluzione al 6% di CHELEX®100, secondo quanto previsto dai metodi affsa EU CRLVersione 1 2009 relativi alla ricerca dei geni delle SEs (AgenceFrançaise de sécuritésanitairedesaliments - European Union Reference Laboratory for Coagulase Positive Staphylococci, including S. aureus).
Identificazione molecolare di S.aureus e ricerca dei geni di resistenza mupA e mecA.
Il DNA così estratto è stato analizzato mediante una multiplex-PCR in grado di rilevare i seguenti geni target: 16S rRNA (specifico del genere Staphylococcus), nuc (specifico dello S. aureus), MecA(per la resistenza alla Meticillina) e mupA (per la resistenza alla Mupirocina) (Zhang et al, 2004). La mix di reazione è stata adattata ad un volume finale di 25µL (20 µL di mix + 5µL di DNA) impiegando il kit commerciale QIAGEN® multiplex-PCR kit con l'aggiunta dei primer ad una concentrazione finale di 0,12µM per 16SF e 16SR, di 0,1µM per nuc1 e nuc2 e di 0,2µM per mupA, mupB, MecA1 e mecA2.
Per ogni sessione sono stati amplificati anche un controllo negativo di estrazione (20µL di Mix + 5µL di soluzione al 6% di CHELEX®100 previa estrazione) e un controllo negativo di amplificazione (20µL + 5µL di acqua nucleasi free). Come controllo positivo di amplificazione invece è stato utilizzato il DNA del ceppo di S. aureus ATCC BAA-1708 portatore di entrambi i geni di resistenza MecA e mupA. Il ciclo termico è stato impostato come segue: pre-attivazione della Taq polimerasi a 95°C per 15'; 10 cicli a 94°C per 40s, 68°C per 40s e 72°C per 1 min; 25 cicli a 94°C per 1 min, 58°C per 1 min e 72°C per 2 min; ed un'estensione finale a 72°C per 10 min.
Ricerca dei geni codificanti per le Enterotossine Stafilococciche.
Il DNA di tutti i ceppi isolati è stato amplificato mediante due multiplex PCR per la ricerca dei geni codificanti le SEs: la prima per la ricerca dei geni sea, seb, sec, sed, see e ser codificanti per le enterotossine rispettivamente di tipo A, B, C, D, E ed R, la seconda per la ricerca dei geni seg, seh, sei, seje sep codificanti rispettivamente per quelle di tipo G, H, I, J e P.
Entrambe le reazioni sono state eseguite in un volume finale di 25 µL contenente 2µL di DNA e 23 µL di miscela di reazione, ottenuta impiegando il kit commerciale QIAGEN® multiplex-PCR kit e attenendosi ai rispettivi metodi EU CRL per le concentrazioni finali dei primer e per i due cicli termici.
Per ogni sessione sono stati amplificati anche un controllo negativo di amplificazione (23µL + 2µL di acqua nucleasi free) e i DNA estratti dai materiali di riferimento forniti dal LNR (IZSPLV Sede di Torino), utilizzati come controlli positivi di amplificazione per i vari target: FRI 137 (sec, seg, seh e sei), FRI 326 (see), FRI S6 (sea e seb) e HMPL 280 (sed, ser, seg, sei, sej e sep).
Visualizzazione degli amplificati.
I prodotti delle PCR sono stati visualizzati elettroforeticamente su gel di agarosio al 2,5% in Tris Borato EDTA (TBE) 1X mediante UVIsave Gel Documentation System (UVITEC Cambridge) e dopo colorazione con intercalante Midori Green Advance DNA Stain secondo le specifiche del fornitore (NIPPON Genetics EUROPE GmbH).
Tabe 1. Multiplex-PCR; research of 16S rRNA,
nuc,
MecA e
mupA genes
Risultati
L'attività di campionamento effettuata nel biennio 2015-2016, ha riguardato, sulla base dei criteri di selezione descritti 14 aziende: 9 situate nella provincia di Macerata e 5 in quella di Fermo. Otto di queste aziende, erano state oggetto di campionamento anche negli anni precedenti e avevano mostrato la presenza di SCP e in molti casi di campioni non conformi.
Ad eccezione di una situata nel maceratese (R), tutte le aziende sono in possesso del numero di riconoscimento ai sensi del Regolamento (CE) n. 853/2004 ed autorizzate per la produzione di prodotti lattiero-caseari. Due delle 14 aziende, una nel fermano (Y) e una nel maceratese (X), sono inoltre autorizzate per la produzione e di latte crudo vaccino e vendita diretta mediante distributori automatici. I distributori automatici controllati sono stati in tutto sette:5 per l'azienda X e 2 per la Y.
Sono stati eseguiti 44 prelievi di cui: 18 di latte di massa, uno di semilavorato (cagliata), 13 di formaggi (di cui 12 a latte crudo e uno a latte pastorizzato), 7 di latte crudo al distributore e 5 tamponi per un totale di 128 campioni analizzati.
La distribuzione dei prelievi sulla base della matrice e dell'azienda è riportata nella Tabella 2.
Table 2. Sampling on each of the farm involved - Biennium 2015-2016
Delle 14 aziende oggetto del campionamento, 12 sono risultate positive per la presenza di SCP e S. aureus e 5 (A, P, Q, R e W) hanno avuto campioni non conformi secondo i criteri del Reg. CE 2073/05. Le due aziende autorizzate alla produzione di latte crudo (X e Y) sono tra quelle positive per la presenza di SCP e S.aureus ma sono risultate entrambe conformi ai limiti di Legge.
Le non conformità rilevate sono state in tutto 11 e hanno riguardato esclusivamente campioni di formaggio. Il Reg. CE 2073/05 e s.m.i. prevede che in un formaggio a base di latte crudo, nessuna u.c. prelevata superi 100.000 UFC/g (M) e non più di due u.c. (c) presentino valori compresi tra 10.000 (m) e 100.000 UFC/g (M). Secondo questo criterio di igiene di processo, 10 formaggi a latte crudo, prelevati in 5 caseifici diversi, sono risultati non conformi: in 9 di essi è stato superato M in tutte le u.c. con valori massimi raggiunti anche di 107 UFC/g, e in uno, tutte le u.c. hanno presentato valori tra m e M.
Per quanto riguarda i formaggi stagionati a base di latte pastorizzato, il criterio indicato nella normativa prevede M= 1.000 UFC/g e c = 2 per valori compresi tra 100 (m) e 1.000 UFC/g (M). L'unico campione analizzato di formaggio a latte pastorizzato (R) è risultato non conforme, con tutte le 5 u.c. con valori superiori ad M e valori massimi di 106 UFC/g. In nessuno degli undici campioni non conformi è stata riscontrata la presenza delle enterotossine stafilococciche.
In seguito alle analisi relative all'attività di campionamento effettuata sono stati collezionati 144 isolati da 12 delle aziende campionate; la distribuzione dei ceppi per matrice di isolamento è riportata nella Tabella 3.
Table 3. SCP isolated. Number and Distribution for each Matrix
Tutti i 144 ceppi di SCP collezionati sono stati identificati come S. aureus mediante multiplex-PCR confermando la precedente identificazione con il metodo biochimico.
Nessuno dei ceppi analizzati ha presentato i geni MecA e mupA relativi rispettivamente alle resistenze alla Meticillina e a alla Mupirocina.
Sette delle 12 aziende dalle quali sono stati isolati i ceppi collezionati, hanno evidenziato la presenza di S.aureus enterotossigeni. Nelle restanti 5 (E, K, R, V, W), la ricerca dei geni codificanti per le SEs ha dato esito negativo. In quattro di queste (K, R, V, W), oggetto di campionamento nel biennio 2015-2016, talvolta sono stati riscontrati campioni non conformi.
Dei 144 ceppi analizzati, 91 sono risultati positivi per almeno uno dei geni codificanti per le 11 tossine stafilococciche risultando pertanto potenzialmente enterotossigeni (Figura 1).
Figure 1.
S. aureus strains, potentially enterotoxigenic
Di questi, 85 hanno dato esito positivo per almeno un gene della prima classe (sea, seb, sec, sed, see e ser) (Figura 2).
Figure 2. Positive strains for at least one SEs first class gene
Il numero di ceppi positivi per ciascun target molecolare e per matrice di isolamento è riportato nella Tabella 4.
Table 4. Number of positive strains by molecular target and isolation matrix
Discussione e conclusioni
Le attività svolte in questo studio hanno permesso di approfondire le conoscenze circa la diffusione e l'epidemiologia di S. aureus all'interno della filiera lattiero-casearia marchigiana in particolare nelle province di Fermo e Macerata; il campionamento, organizzato dopo attenta valutazione delle realtà aziendali presenti sul territorio, ha potenziato l'azione di controllo relativamente alla problematica.
Dai dati ottenuti è emerso che la circolazione di SCP all'interno delle 14 aziende oggetto di campionamento è piuttosto diffusa con l'86% delle aziende risultate positive e in alcuni casi con campioni al di sopra dei limiti normativi.
Nel 42% delle aziende nelle quali da almeno un prelievo sono stati isolati SCP, infatti, si sono avuti campioni non conformi ai sensi del Reg. CE n. 2073/2005 con valori massimi di 107 UFC/g nel caso di formaggi al latte crudo e 106 UFC/g per quelli al latte pastorizzato. In nessuno dei campioni non conformi è stata però riscontrata la presenza di enterotossine stafilococciche.
Complessivamente gli SCP raccolti e collezionati sono stati 144, la maggior parte dei quali isolati da formaggi (52%), il 22% da campioni di latte crudo prelevato al distributore, il 21% da latte di massa ed il restante 5% da semilavorati e campioni ambientali.
Tutti gli isolati analizzati mediante multiplex-PCR specifica per S. aureus, sono stati identificati come Staphylococcus aureus confermando che questa è la specie di SCP più diffusa nella filiera lattiero-casearia. Risultati simili sono stati ottenuti anche in altri studi (Normanno et al. 2005; Linage et al. 2012).
La caratterizzazione molecolare relativa ai geni codificanti per le enterotossine stafilococciche ha evidenziato nel territorio una presenza diffusa di ceppi di S. aureus con potenziale enterotossigeno, ovvero ceppi risultati positivi per almeno uno dei target molecolari codificanti per le 11 enterotossine.
Delle 12 aziende da cui derivano gli isolati analizzati, infatti, in 7 (58%) sono stati rivenuti ceppi enterotossigeni. In quattro delle aziende risultate negative alla ricerca dei target per SEs sono stati comunque riscontati campioni di formaggio al latte crudo non conformi con valori di SCP superiori a 106 UFC/g. Questo evidenzia la necessità di migliorare comunque le condizioni igieniche durante il processo produttivo e/o la scelta delle materie prime, al fine del contenimento del rischio per il consumatore a livelli accettabili. Qualora infatti, nelle aziende in questione fossero introdotti ceppi potenzialmente enterotossigeni, si potrebbero verificare le condizioni per la produzione di SEs.
La prevalenza dei ceppi enterotossigeni riscontrata (63%) è simile a quella osservata in letteratura (Scherrer et al., 2004). Inoltre, il 93% di questi ceppi, dispone nello specifico dei geni associati alle enterotossine definite "classiche" (A, B, C, D, E) per le quali è noto il coinvolgimento in casi di intossicazione alimentare (Argudín et al., 2010). Dei geni appartenenti a questo gruppo sec è stato quello più comunemente rinvenuto analogamente a quanto riportato da Scherrer et al., 2007 , seguito da sea (Tabella 4).
Questi risultati confermano, per gli operatori del settore lattiero-caseario ed in particolare per le aziende con ceppi enterotossigeni circolanti, l'importanza dell'applicazione delle buone prassi di produzione del latte (es. mungitura), della corretta individuazione e del puntuale monitoraggio dei punti critici di controllo del processo di caseificazione (es. rispetto della catena del freddo). Questo al fine di prevenire il verificarsi di condizioni favorevoli per la moltiplicazione di SCP e per la produzione di enterotossine. Alla stessa stregua i risultati ottenuti nel corso di questo studio rappresentano un valido aiuto per l'Autorità Competente al fine di pianificare in maniera più efficace ed efficiente l'attività di Controllo Ufficiale nelle aziende interessate dalla problematica.
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