Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 102, Giugno 2017 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
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Sviluppo e validazione di un metodo in Multiplex Real-Time PCR per l'identificazione rapida di ceppi virulenti di Listeria monocytogenes in prodotti "ready to eat" (RTE)
Development and validation of a Multiplex Real-Time PCR method for the rapid identification of virulent strains of Listeria monocytogenes in "ready to eat" (RTE) products


Martina Foglini1, Eleonora Micci1, Giuliana Blasi1, Fabrizia Guidi1, Barbara Palombo1, Stefania Scuota1, Anna Duranti1, Stefano Fisichella1, Monica Virginia Gianfranceschi2, Francesco Pomilio3, Giulia Amagliani4, Francesco Tonucci1, Giuditta Fiorella Schiavano4, Elisa Carloni4, Annalisa Petruzzelli1



(1) Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
(2) Istituto Superiore di Sanità
(3) Laboratorio Nazionale di Riferimento per Listeria monocytogenes - Istituto Zooprofilattico Sperimentale Abruzzo Molise
(4) Dipartimento di Scienze Biomolecolari, Università degli Studi di Urbino "Carlo Bo"



Abstract. Aim of the study is to develop and validate a multiplex real-time PCR (m rt-PCR) method for the identification of Listeria monocytogenes together with some of the main virulence markers (lapB and inlJ) of this species in food matrices (RTE) and clinical isolates from listeriosis cases in Marche and Umbria regions (2014-2016). The EFSA report (2016) on animal diseases indicates Listeria monocytogenes as the zoonoses with the highest rate of hospitalization with 2206 confirmed cases of listeriosis in Europe, with a death rate of 17.7%. Analytical methods currently in use are limited to the identification of Listeria monocytogenes species, without distinguishing virulent from non-virulent strains. Therefore all food samples found to be positive for Listeria can be considered at risk for consumer health regardless of their virulence. The presence of specific virulence genes can be considered as important targets in laboratory diagnosis. Microbiological analysis undertaken on RTE matrices showed a prevalence of positive samples for Listeria monocytogenes of 25.26%. The biomolecular analysis (m rt-PCR) on food isolates confirmed all the positivity detected by microbiological method, noting that 68.75% were positive for all the 3 target genes while 31.25% only for two of them. All the 57 clinical strains of Listeria monocytogenes responsible for human listeriosis collected showed the simultaneous presence of all 3 virulence genes. The developed molecular method is therefore able to discriminate the Listeria monocytogenes on the basis of the presence of 3 virulence target (hlya, inlJ, lapB)

Riassunto. L'ubiquitarietà e l'elevata capacità di crescere o sopravvivere in un ambiente refrigerato rendono Listeria monocytogenes un pericolo nell'ambito della produzione alimentare. In particolare, viste le caratteristiche fisico-chimiche e le modalità di conservazione, gli alimenti Ready to eat (RTE) rappresentano un buon substrato per la crescita del germe. I metodi analitici attualmente in uso per l'identificazione di Listeria monocytogenes non consentono di distinguere i ceppi virulenti da quelli non virulenti; pertanto, tutti i campioni alimentari risultati positivi alla specie vengono considerati a rischio per la salute del consumatore a prescindere dalla loro patogenicità. Lo scopo del lavoro è stato quello di sviluppare e validare un metodo in multiplex real-time PCR (m rt- PCR) per l'identificazione di Listeria monocytogenes e di alcuni dei principali marker genetici di virulenza di questa specie (hlyA, lapB e inlJ) in matrici alimentari (RTE) e isolati clinici derivanti da casi umani di listeriosi delle regioni Marche e Umbria (2014-2016). L'analisi microbiologica delle matrici alimentari ha evidenziato una prevalenza di positività alla Listeria pari al 25.26%. L'analisi biomolecolare (m rt-PCR) degli isolati alimentari ha confermato tutte le positività rilevate con metodo microbiologico evidenziando in particolare che il 68.75% degli isolati alimentari è risultato positivo a tutti e 3 i geni target mentre il 31.25% solo a 2 di essi. L'analisi dei 57 ceppi clinici di Listeria monocytogenes responsabili di listeriosi umana ha mostrato la presenza contemporanea di tutti e 3 i geni di virulenza (hlyA, inlJ, lapB). Tuttavia la dimostrazione di una minore patogenicità dei ceppi mancanti di uno o più geni target dovrà necessariamente essere dimostrata attraverso ulteriori saggi diagnostici (prove in vivo o colture cellulari)



Introduzione
Nel corso del triennio 2014-2016, il Laboratorio Controllo Alimenti della sezione Sezione di Pesaro dell'IZSUM, in collaborazione con la sede Sede di Perugia, le sezioni Sezioni di Fermo, Tolentino e Ancona (Osservatorio Epidemiologico), l'Università degli Studi di Urbino, l'Istituto Superiore di Sanità e il Laboratorio Nazionale di Riferimento per Listeria monocytogenes (LNR), è stato capofila del progetto di ricerca corrente RC 05/13 ("Sviluppo e validazione di un metodo in multiplex real-time PCR per l'identificazione rapida di ceppi virulenti di Listeria monocytogenes in prodotti "ready to eat" (RTE))".
Il report EFSA 2016 indica la Listeria monocytogenes quale zoonosi con il più alto tasso di ospedalizzazione tra quelle comprese nella sorveglianza europea, con 2206 casi confermati di listeriosi in Europa e un tasso di mortalità del 17.7%.
Le capacità di questo germe di sviluppare alle temperature di refrigerazione, di resistere agli agenti fisico-chimici e di determinare la formazione di biofilm, favoriscono la colonizzazione di strumentazioni e superfici di lavorazione nell'ambito della produzione alimentare. Viste le caratteristiche fisico-chimiche e le modalità di conservazione, gli alimenti Ready to eat (RTE) rappresentano un buon substrato per la crescita del germe.

La più virulenta e la più frequentemente isolata da casi di malattia nell'uomo e negli animali risulta essere Listeria monocytogenes. I metodi analitici attualmente in uso si limitano però all'identificazione della specie Listeria monocytogenes, senza distinguere i ceppi virulenti da quelli non virulenti; ciò potrebbe comportare una sovrastima delle positività rilevate e del reale rischio per la salute del consumatore.
La virulenza di Listeria monocytogenes è condizionata da una serie di fattori propri del microrganismo stesso (Hof et al., 1992).
Tra i più importanti fattori di virulenza coinvolti nei meccanismi di patogenesi di Listeria monocytogenes ci sono le internaline (proteine di superficie), la listeriolisina O (proteina che permette l'invasione dell'epitelio) e la proteina di adesione lapB, che rappresentano dunque degli utili target nelle diagnosi di laboratorio.

Materiali e metodi
La prima fase dello studio ha previsto lo sviluppo e l'ottimizzazione di un metodo di multiplex real-time PCR (m rt- PCR) mediante la selezione di alcuni tra i target genetici più frequentemente associati ai ceppi virulenti: lapB, inlJ e hlyA. La messa a punto del metodo è stata effettuata su 41 ceppi di Listeria monocytogenes isolati da casi di patologia nell'uomo, reperiti in parte dall'ISS e in parte da alcune Aziende Sanitarie Ospedaliere della regione Marche.
Dopo aver testato separatamente ciascun target genetico al fine di valutarne l'efficienza di amplificazione, i diversi set di primer e probes, incluso un controllo interno di amplificazione (IAC), sono stati assemblati in un unico saggio di tipo multiplex eseguito con kit Quantifast Pathogen PCR+IC-QIAGEN. Al fine di valutare la concordanza del metodo ottimizzato con quello colturale di riferimento, è stata effettuata una validazione mediante contaminazione artificiale di un prodotto RTE (prosciutto cotto) precedentemente testato in 5 u.c. per la conferma della negatività a Listeria monocytogenes. I campioni sono stati analizzati parallelamente con il metodo colturale di riferimento e con il metodo biomolecolare.
Lo studio ha quindi previsto l'analisi di matrici alimentari RTE, prelevate nell'ambito dei piani alimenti regione Marche e Umbria e campionate in 5 u.c. secondo i criteri del Reg. (CE) 2073/2005 e s.m.i.

Tutti i campioni sono stati analizzati per la ricerca di Listeria monocytogenes attraverso due metodi equivalenti accreditati (ISO 11290-1:2005, AFNOR BIO 12/11-03/04) e successiva conferma dei positivi attraverso metodo di isolamento. Il DNA batterico estratto dai pellet dei brodi di arricchimento selettivo (Fraser Broth) risultati positivi alle analisi microbiologiche è stato quindi amplificato con il protocollo di m rt-PCR precedentemente validato. Lo studio ha inoltre previsto l'analisi (m rt- PCR e PFGE) di 57 ceppi clinici di Listeria monocytogenes isolati da casi di listeriosi umana dai laboratori ospedalieri delle regioni Marche e Umbria e inviati all'IZSUM tra il 2014 e il 2016.

Risultati
Sulla base dei risultati ottenuti in fase di ottimizzazione del metodo si è deciso di utilizzare, quali target della m RT PCR, i geni lapB e inlJ, oltre al gene hlyA, necessario per l'identificazione della specie Listeria monocytogenes. Nell'assemblare i tre target di amplificazione in un unico saggio di multiplex, aggiungendo inoltre un sistema di IAC, sono stati osservati elevati livelli di efficienza e di sensibilità.
La fase di validazione del metodo effettuata mediante il confronto in parallelo del metodo colturale di riferimento e del metodo biomolecolare, ha evidenziato una completa concordanza dei risultati ottenuti con le due metodiche. Per ciascuna ripetizione dei tre livelli di contaminazione testati (1-10-100 UFC) è stato possibile identificare la presenza dei tre geni ricercati, mentre i campioni non contaminati sono sempre risultati negativi. Nel corso dello studio, sono stati prelevati 190 campioni alimentari, in cinque unità campionarie (u.c.) per un totale di 850 u.c. I tipi di matrice alimentare più frequentemente campionati sono stati rappresentati da prodotti lattiero-caseari e prodotti carnei fermentati.
Il 25.26% dei campioni alimentari (48) analizzati con il metodo microbiologico, sono risultati positivi per la presenza di Listeria monocytogenes in 25 grammi. La maggior parte delle positività riscontrate (tabella 1) si è verificata nella matrice salame fresco, seguita da formaggi, ciauscolo, coppa, carne cruda di suino e lonza, in linea con le evidenze europee (EFSA 2016).

Tabella 1: Risultati delle analisi microbiologiche condotte sulle matrici RTE campionate nel Piano Alimenti.
Table 1. Results of microbiological analyzes conducted on RTE matrices, sampled in the "Food Plan"


Le positività riscontrate in fase di analisi microbiologica sono state confermate con il metodo biomolecolare per tutti i campioni sottoposti ad analisi (tabella 2). Tutti i campioni positivi alla metodica colturale sono stati confermati in m rt-PCR per la presenza del gene hlyA, gene della listeriolisina responsabile dell'identificazione della specie Listeria monocytogenes.
Uno solo dei 48 campioni confermati, è risultato negativo al gene lapB, codificante per una "peptidoglycan-linked protein". Il campione in questione è rappresentato da un campione di coppa, risultato positivo alla metodica ELFA per le 5 u.c., ma non confermato mediante isolamento. Infine, 14 dei 48 campioni confermati, hanno dato negatività alla ricerca del gene inlJ, responsabile per la codifica dell'internalina j. L'assenza del gene inlJ si è verificata con maggiore frequenza in campioni di origine animale (carni e prodotti a base di carne), rappresentati in particolare da 4 campioni di salame fresco, 2 di coppa e 3 di lonza, 1 di porchetta, 1 di ciauscolo oltre che in 2 di formaggio e 1 di pasta filata. Il 69% (33) dei campioni è risultato positivo a tutti e 3 i geni target mentre il 29% (14) hanno dato positività solo a due geni (hlyA e lapB). Infine un solo campione (2%) è risultato positivo ai geni hlyA e inlJ (tab.2 e fig.1).

Tabella 2: Risultati delle analisi biomolecolari in m rt-PCR condotte sui campioni risultati positivi
Table 2. Results of biomolecular analysis in mt-rt-PCR, conducted on positive samples




Figura 1. Prevalenze di positività ai tre geni di virulenza nelle matrici alimentari
Figure 1. Positivity prevalence to the three genes of virulence, in food matrices


Relativamente agli isolati clinici sottoposti a m rt-PCR sono risultati tutti positivi ai tre geni testati (hlyA, lapB, inlJ). Dall'analisi dei profili di restrizione ottenuti mediante PFGE è stato possibile evidenziare che l'11.4% dei ceppi testati hanno lo stesso profilo di restrizione (ApaIGX6A12.0063, AscIGX6A16.0183).

Discussione e conclusioni
L'attività svolta in questo studio ha consentito di sviluppare e validare un metodo in m rt-PCR per l'identificazione di Listeria monocytogenes e di alcuni dei principali marker genetici di virulenza (hlyA, lapB e inlJ) di questa specie in matrici alimentari (RTE) e isolati clinici da casi di listeriosi. Il saggio di m RT PCR si avvantaggia di una maggiore sensibilità e tempi analitici ridotti rispetto ai metodi colturali tradizionali. Nel nuovo metodo è stato introdotto un controllo interno di amplificazione (IAC), indispensabile per evidenziare eventuali falsi negativi dovuti alla presenza di inibitori, come indicato nella norma ISO 22174:2005.
L'ottimizzazione del metodo ha permesso di ottenere elevati livelli di efficienza e di sensibilità.
La validazione del metodo messo a punto con materiali certificati e la sua applicazione su matrici di campo, a confronto con i metodi di riferimento, ha permesso di definire l'efficacia e l'affidabilità della procedura. Ciò consente di avere a disposizione un metodo alternativo validato rapido di screening per analisi di routine. Tuttavia in caso di risultati positivi è indispensabile procedere all'isolamento del germe con metodi colturali tradizionali. L'analisi con metodo microbiologico di matrici RTE prelevate nell'ambito del piano alimenti Marche e Umbria ha evidenziato una prevalenza di campioni positivi per Listeria monocytogenes pari al 25.26% (48). La maggior parte delle positività riscontrate si è verificata nella matrice salame fresco, che rappresenta anche a livello europeo (EFSA 2016) uno tra i prodotti alimentari maggiormente contaminati. Successivamente le matrici più a rischio sono risultate: formaggi, ciauscolo, coppa, carne cruda di suino e lonza, in linea con le evidenze europee.

L'analisi biomolecolare (m rt-PCR) degli isolati alimentari ha confermato tutte le positività rilevate con metodo microbiologico evidenziando in particolare:

Dall'analisi biomolecolare si è evidenziato che il 68.75% degli isolati alimentari è risultato positivo a tutti e 3 i geni target mentre il 31.25% solo a 2 di essi. Inoltre dai dati ottenuti si è evidenziato che la presenza dei geni di virulenza non è associabile con una particolare matrice alimentare in quanto essi sono presenti in maniera variabile in diversi prodotti.
Tutti gli isolati clinici sono stati sottoposti a tipizzazione mediante PFGE e ad analisi biomolecolare con il metodo m rt-PCR. Dai risultati ottenuti è stato possibile rilevare che parte dei ceppi testati hanno prodotto lo stesso profilo di restrizione, risultando pertanto derivanti da uno stesso ceppo clonale e aventi dunque fonte di infezione comune.

L'analisi biomolecolare ha invece evidenziato la presenza contemporanea di tutti e 3 i geni di virulenza testati; ciò porterebbe a pensare che tali geni siano notevolmente implicati nella virulenza del germe. Tuttavia la dimostrazione di una minore patogenicità dei ceppi mancanti di uno o più geni target dovrà necessariamente essere dimostrata attraverso ulteriori saggi diagnostici (prove in vivo o colture cellulari).
Inoltre occorre sottolineare che non sempre i ceppi considerati potenzialmente patogeni grazie alla rilevazione dei fattori di virulenza nel genoma sono anche in grado di scatenare la malattia nell'uomo, poiché nella realtà possono incontrare difficoltà nell'attraversamento intestinale o di altre barriere dell'ospite durante l'infezione. Inoltre, affinché Listeria monocytogenes possa causare la malattia, devono intervenire altri fattori importanti, alcuni propri del microrganismo stesso, altri costituiti dalla differente natura del substrato alimentare e dalle condizioni dell'ospite in cui il batterio penetra. Il meccanismo patogenetico di questa specie risulta dunque complesso ed articolato.

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OPEN REVIEW - Modulo per la "revisione aperta" di questo articolo, pubblicato sul numero 102/2017 di SPVet.it



Foglini et al., Sviluppo e validazione di un metodo in Multiplex Real-Time PCR per l'identificazione rapida di ceppi virulenti di <em>Listeria monocytogenes</em> in prodotti
Foglini et al., Sviluppo e validazione di un metodo in Multiplex Real-Time PCR per l'identificazione rapida di ceppi virulenti di Listeria monocytogenes in prodotti "ready to eat" (RTE) (SPVet.it 102/2017)




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