Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 105, Dicembre 2017 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
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Effetto del desametasone a dosi anabolizzanti sulla morfologia e sul profilo di espressione del timo in vitelloni di razza chianina
Effect of dexamethasone at anabolic doses on the morphology and expression profile of the thymus in Chianina breed veals


Elisabetta Manuali1, Livia Moscati1, Andrea Antolini1, Roberta Galarini1, Simone Moretti1, Giorgio Saluti1, Danilo Giusepponi1, Elena Bozzetta2, Valentina Audino2, Bartolomeo Biolatti3, Francesca Tiziana Cannizzo3, Paola Pregel3, Sara Divari3, Alessandra Sereno3, Enrica Berio3, Stefano Mezzasoma4, Elisabetta Pistidda4, Claudia Moncada4, Maurizio Bordoni4, Carmen Maresca1, Eleonora Scoccia1



(1)Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Togo Rosati
(2) Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d'Aosta
(3) Dipartimento di Scienze Veterinarie - Università degli Studi di Torino
(4) USL Umbria 1 - UOC Igiene Allevamenti e Produzioni Zootecniche



Abstract. The use of synthetic and natural hormones as growth promoters has been banned in the European Union by Directive 96/22 / EC. The need to protect the health of consumers from the risk related to the presence of residues is closely linked to the adoption of reliable control systems, designed to identify optimal screening methods. The rapid metabolism and elimination of these substances, the use of combinations of different substances with synergistic effect and the use of undetected molecules, makes the chemical investigations sometimes not conclusive. The aim of National Residues Plan (PNR) is to ensure the public health by surveillance and monitoring of the presence of chemical residues in animals and animal products. The aim of the present study was to evaluate the reliability of the histological evaluation of the thymus gland, as well as the serum and urine cortisol determination, in identifying Chianina beef cattle treated with dexamethasone-based growth-promoting protocol.

Riassunto. L'uso di ormoni sintetici e naturali come promotori della crescita è stato bandito nell'Unione europea dalla Direttiva 96/22/CE. La necessità di proteggere la salute dei consumatori dal rischio relativo alla presenza di residui è strettamente legata all'adozione di sistemi di controllo affidabili, progettati per identificare metodi ottimali di screening. Il rapido metabolismo e l'eliminazione di queste sostanze, l'uso di combinazioni di diverse sostanze con effetto sinergico e l'uso di molecole non rilevate, rendono talvolta non determinanti le indagini chimiche. L'obiettivo del Piano nazionale Residui (PNR) è quello di garantire la salute pubblica attraverso la sorveglianza e il monitoraggio della presenza di residui chimici negli animali e nei prodotti animali. Lo scopo del presente studio è stato quello di valutare l'affidabilità della valutazione istologica della ghiandola timica, nonché la determinazione del cortisolo di siero e urina nell'identificazione dei bovini di carne Chianina trattati con dexametasone, sostanza fraudolentemente utilizzata quale promotore di crescita



Definizione della ricerca svolta
L'utilizzo fraudolento di promotori della crescita in zootecnia, in particolare negli allevamenti bovini, richiede indagini costanti presso allevamenti e macelli e determina un impegno economico e operativo oneroso per il sistema veterinario pubblico. Le molecole illecitamente impiegate, e i loro metaboliti, possono entrare nella filiera alimentare con effetti potenzialmente pericolosi per il consumatore rendendo necessaria la presenza di sistemi di sorveglianza permanente e di controlli ufficiali organizzati come previsto dai programmi europei di garanzia per la sicurezza alimentare.

I corticosteroidi, normalmente utilizzati nella pratica clinica veterinaria come farmaci ad azione anti-infiammatoria e immunosoppressiva, trovano largo impiego in zootecnia come promotori della crescita. Il vantaggio nell'utilizzare tali sostanze a scopo auxinico risiederebbe nel basso costo delle stesse, associato ad un'alta efficacia oltre che alla rapida cinetica di eliminazione, soprattutto per quanto riguarda il desametasone (DMT). Tali composti determinano effetti zootecnici considerati "favorevoli" in quanto in grado di migliorare il valore della carcassa alla macellazione a motivo dell'incremento ponderale giornaliero dovuto all'ipertrofia delle masse muscolari e al colore meno intenso delle stesse, come richiesto dal consumatore.
Con la Ricerca Corrente (IZSUM 19/2010 RC) abbiamo approfondito le conoscenze nell'ambito dell'istologia applicata al timo di vitelloni di razza Chianina studiandone i quadri morfologici che regolano i fenomeni di involuzione fisiologica, probabilmente più precoce per fattori legati alla razza, al fine di rendere più accurata l'interpretazione dei preparati fornendo un contributo volto alla definizione degli standard di controllo, ovvero le classi di normalità per razza ed età di appartenenza in relazione al grado di atrofia.

Tale parametro è ritenuto di estremo interesse perché permetterà di ampliare la capacità di riconoscimento di trattamento illecito in animali regolarmente macellati. Allo stato attuale, infatti, non sono disponibili in letteratura sufficienti dati scientifici riguardanti gli effetti fisiologici dei corticosteroidi sul timo di bovini da carne e scarsi sono gli studi sperimentali inerenti il comportamento della ghiandola nei bovini da carne sottoposti a trattamento con tali sostanze. Infine, il recente sviluppo delle tecniche istologiche, le sempre più sofisticate analisi chimiche e la moderna applicazione delle cosiddette tecniche "omiche" (genomica, proteomica, metabolomica) candidate a essere utilizzate come indicatori indiretti di trattamento (biomarcatori) stanno definendo, nel loro insieme, un panorama che presenta prospettive estremamente interessanti per un possibile utilizzo pratico nel breve e medio periodo.

Il progetto si prefigge di ottenere nuove conoscenze nell'ambito dell'interpretazione microscopica del timo (considerato l'organo target di trattamento con corticosteroidi) in vitelloni di razza Chianina, partendo dalla definizione dei parametri di normalità per arrivare alla caratterizzazione dei differenti quadri di atrofia che potranno essere considerati indicatori di trattamento. La definizione degli standard "normotipici" nonché di quelli "DMT-dipendenti" associabili alla razza e all'età dei soggetti appartenenti a tale categoria fornirà un contributo anche ai fini comparativi, per un confronto dei dati con quelli attualmente disponibili per le altre razze da carne studiate (Biolatti B et al. 2005, Cannizzo FT et al. 2008, Cannizzo FT et al. 2010, Bozzetta E et al. 2011, Vascellari M et al. 2012), al fine di estendere le osservazioni morfologiche e rendere l'esame istologico in tale categoria ancora più efficace su scala nazionale. L'approccio multidisciplinare individuato servirà anche ad avviare un percorso di validazione atto a fornire linee guida per l'applicazione di metodiche, chimiche e molecolari, per la ricerca rispettivamente delle sostanze vietate e delle modificazioni genetiche indotte dalle stesse quali indagini di conferma.

Obiettivi:
Sintesi dei materiali e metodi
Protocollo sperimentale: 16 vitelloni maschi di un anno di età (8 trattati e 8 controlli). Trattamento con DMT 0.7mg/capo/os al giorno per 30 giorni. Sospensione del trattamento 5 giorni prima della macellazione. Prelievo settimanale di sangue e urina (T0-T5), prelievo di organi, sangue e urina al mattatoio (T6).
Analisi ematologiche e chimico-cliniche (Alb, ALP, Bil-tot, Ca, Col, Cl, Crea, P, GGT, GOT, GPT, LDH, Prot-tot). Analisi chimico-analitiche mediante cromatografia liquida interfacciata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) dei corticosteroidi (siero e urine). Analisi istologiche (grado di atrofia del timo toracico), morfometriche (timo: rapporto corticale-midollare) e immunoistochimiche (Cleaved caspase 3, Cleaved lamin A, Ki67).
Analisi biomolecolari: studio dei principali geni coinvolti nella cascata apoptotica (timo toracico: estrazione dell'mRNA totale, quantificazione dell'RNA, retrotrascrizione in cDNA, PCR quantitativa, quantificazione dell'espressione genica.
Analisi statistica: per una corretta analisi dei dati sono stati impiegati test parametrici (one-way ANOVA) e non parametrici (Kruskal-Wallis rank sum test) in dipendenza della natura del dato.

Descrizione delle prospettive future
Studi effettuati utilizzando varie razze bovine hanno dimostrato che la somministrazione prolungata di DMT induce atrofia dose-dipendente e che, dopo la sospensione del farmaco, il parenchima del timo è in grado di rigenerarsi ritornando quasi alla normalità (Cannizzo FT et al. 2008). Con la presente ricerca, abbiamo dimostrato che anche nella razza Chianina la somministrazione di basse dosi DMT per un mese, fino a 5 giorni prima della macellazione, provoca grave atrofia del timo, caratterizzata dalla quasi totale scomparsa della corticale dei lobuli per la deplezione del tessuto linfoide che viene sostituito da tessuto adiposo.
Tale alterazione influenza in modo significativo anche il peso del timo, quando viene prelevato circa un mese dopo la fine trattamento, fenomeno non osservato nei soggetti del gruppo controllo dove sia il peso che la morfologia del timo è sovrapponibile a quella riscontrata nei vitelli. Tale fenomeno influisce anche su un altro parametro, ovvero sul rapporto peso timo - peso carcassa, che risulta notevolmente ridotto nel gruppo trattati, analogamente a quanto riscontrato da Biolatti (2005) e Cannizzo (2008), e che potrebbe essere tenuto in considerazione in sede di macellazione.

I risultati dell'esame istologico sono in linea con quelli evidenziati dalle indagini morfometriche. Infatti, i bovini trattati con DMT, che hanno presentato un quadro di grave atrofia, hanno mostrato anche un valore medio del rapporto diametro corticale/midollare del timo di 0.62, valore sovrapponibile (Vascellari et al., 2012) o addirittura inferiore (Bozzetta et al., 2011) a quelli riportati in bibliografia in bovini trattati sperimentalmente con corticosteroidi.
Come già riportato in letteratura, i nostri risultati indicano che il rapporto corticale/midollare è un parametro semplice e oggettivo, utile per la rilevazione di trattamento illecito con basse dosi di DMT in quanto fortemente associato al trattamento con corticosteroidi. Infine, tale indagine conferma che la diminuzione del peso del timo e sue modificazioni istologiche caratterizzate da grave atrofia della componente linfoide e la sua sostituzione con tessuto adiposo, sono buoni indicatori di recente somministrazione di corticosteroidi e, pertanto, confermano l'utilità dell'esame istologico quale metodo di screening, come previsto dal Piano Nazionale Residui.

Questo può essere considerato uno studio pilota in quanto effettuato per la prima volta in bovini italiani di razza bianca (Chianina) i cui risultati andranno a implementare i dati presenti in letteratura al fine di ampliare la capacità di riconoscimento di eventuali trattamenti illeciti in animali regolarmente macellati. Prospettive future:
  1. completare il patrimonio di informazioni utili a rendere più efficaci le strategie dei piani di sorveglianza dei residui, in ottemperanza a quanto disposto dal Ministero della Salute in materia di sorveglianza dei trattamenti con promotori di crescita nell'allevamento bovino;
  2. estendere le valutazioni istologiche e immunoistochimiche ad altri potenziali organi target;
  3. estendere le analisi chimiche alla matrice bile; 4) elevare il livello di sicurezza delle produzioni di carni bovine in Umbria.

Bibliografia

Direttiva 96/22/CE del Consiglio, del 29 aprile 1996, concernente il divieto di utilizzazione di talune sostanze ad azione ormonica, tireostatica e delle sostanze ß-goniste nelle produzioni animali e che abroga le direttive 81/602/CEE, 88/146/CEE e88/299/CEE Gazzetta ufficiale n. L 125 del 23/05/1996 pag. 0003-0009.

Biolatti B et al. (2005). Effects of low-dose dexamethasone on thymus morphology and immunological parameters in veal calves. J. Vet. Med. A, Vol. 52, pp 202-208.

Cannizzo FT et al. (2008). Effects of anabolic andtherapeutic doses of dexamethasone on thymus morphology and apoptosis in veal calves. Vet. Rec. Vol. 163, pp 448-452.

Cannizzo FT et al. (2010). Thymus atrophy and regeneration following dexamethasone administration to beef cattle. Vet. Rec., Vol. 167, pp 338-343.

Bozzetta E et al. (2011). Development of an enhanced histopathological approach to detect low-dose dexamethasone illicit treatment in veal calves. Food Additives & Contaminants: Part A, 28:9, 1187-1192.

Vascellari M et al. (2012). Evaluation of thymus morphology and serum cortisol concentration as indirect biomarkers to detect low-dose dexamethasone illegal treatment in beef cattle. BMC Veterinary Research 2012, 8:129.


OPEN REVIEW - Modulo per la "revisione aperta" di questo articolo, pubblicato sul numero 105/2017 di SPVet.it



Manuali et al. 2017. Percorso di Certificazione UNI EN ISO 9001: 2015 presso il reparto Produzione terreni colturali dell'Officina Farmaceutica dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche

Manuali et al., 2017. Effetto del desametasone a dosi anabolizzanti sulla morfologia e sul profilo di espressione del timo in vitelloni di razza chianina (SPVet.it 105/2017)





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