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Studio di prevalenza, conta e tipizzazione molecolare di Campylobacter spp. nei broiler macellati nella Regione Marche
Survey on Campylobacter spp. prevalence, counts and molecular typing in broiler chickens slaughtered in the Marche Region (Italy)
Survey on Campylobacter spp. prevalence, counts and molecular typing in broiler chickens slaughtered in the Marche Region (Italy)
Valentina Silenzi, Lucilla Cucco, Alessandra Morelli, Marta Paniccià, Anna Duranti
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Togo Rosati
Abstract. Campylobacter has been identified as one of the most frequent causes of bacterial foodborne enteric disease, with more than 200,000 confirmed human cases/year (EFSA-ECDC 2015) and 48 cases per 100,000 population in European Union countries.
Poultry has been recognised as elective reservoir for the transmission of Campylobacter to humans and, because of the significant impact that Campylobacteriosis has on public health and socio-economic system, the EU has adopted an integrated approach to food safety, involving the entire chain, from 'farm to fork'.
In fact, in 2008 a reference survey was carried out at slaughterhouse level to compare prevalence and levels of contamination by Campylobacter spp. in batches and carcasses of broilers in the European Union (EFSA JOURNAL 2010).
This was followed by EFSA's 2010 and 2011 opinions which led the European Commission to set up a process hygiene criterion for Campylobacter spp. in the carcasses of broilers.
This criterion for Campylobacter will follow the same test approach of the criterion established for Salmonella, that is with the use of the same samples of neck skin, as described in Regulation (EU) 2017/1495 of the Commission of 23 August 2017 that modifies the Regulation (EC) n. 2073/2005 and which will be applied starting from 1/01/2018.
Given the new legislation and the fact that scientific studies have shown that the risk related to chicken meat is strongly associated with the high charges of Campylobacter spp. rather than its dissemination (EFSA, 2009; EFSA, 2011; Nauta et al., 2009), the purpose of this study, carried out by the Laboratory of Diagnostics of the Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Seat of Fermo in the year 2017, was a quantitative approach to monitoring Campylobacter spp. in broilers at slaughterhouse and its molecular typing.
The most representative poultry slaughterhouse of the Marche Region was chosen as the place of collection, where, during the year, caecal content, skin of the neck and skin of the breast of broiler chickens were taken from each batch.
These samples were subjected to Campylobacter spp. counts, molecular typing, phylogenetic analysis using Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and Multilocus sequence typing (MLST) and to antibiotic resistance studies.
For the advanced genotypic analysis of the strains isolated from the different matrices and the different batches at slaughterhouse, we have been collaborating with the National Campylobacter Reference Laboratory (IZSAM Teramo).
The construction of the phylogenetic tree, the interpretation of the correlations among the strains, the study of the antibiotic resistance, as well as the evaluation of any cross-contamination or impacts related to the management of breeding, are still ongoing.
The future goal, for the year 2018, is the study of any phylogenetic correlation between Campylobacter spp. isolated in recent years from chicken breasts, belonging to the same companies sampled at the slaughterhouse in the year 2017, and the strains isolated in this project.
Our attention will also be directed to the human field, in order to obtain a complete phylogenetic correlation study that includes strains isolated in the farm, at slaughterhouse, in the canteens and in the hospitals.
Riassunto. Il Campylobacter è stata identificato come una delle più frequenti cause di malattie batteriche gastrointestinali di origine alimentare, con più di 200.000 casi notificati ogni anno nell'uomo (EFSA-ECDC 2015) e 48 casi ogni 100.000 abitanti nei paesi dell'Unione Europea.
Il pollame è stato riconosciuto come reservoir elettivo per la trasmissione del Campylobacter all'uomo e il considerevole impatto che la Campylobacteriosi ha sulla salute pubblica e sul sistema socio-economico ha spinto l'UE a adottare un approccio integrato alla sicurezza alimentare che interessa l'intera filiera, dall'azienda agricola alla tavola.
Infatti nel 2008 è stata condotta un'indagine di riferimento a livello di macelli volta a comparare prevalenza e livelli di contaminazione da Campylobacter spp. nelle partite e nelle carcasse dei polli da carne nell'Unione Europea (EFSA JOURNAL 2010).
Ad essa sono seguiti pareri dell'EFSA del 2010 e 2011 che hanno portato la Commissione Europea a predisporre un criterio di igiene di processo per il Campylobacter spp. nelle carcasse di polli da carne.
Tale criterio per il Campylobacter seguirà lo stesso approccio di prova del criterio stabilito per la Salmonella, ovvero con l'utilizzo degli stessi campioni di pelle di collo, secondo quanto descritto nel Regolamento (UE) 2017/1495 della Commissione del 23 agosto 2017 che modifica il Regolamento (CE) n. 2073/2005 e che si applicherà a partire dal 1/01/2018.
Alla luce della nuova normativa e del fatto che studi scientifici hanno dimostrato che il rischio legato alla carne di pollo è fortemente associato alle alte cariche di Campylobacter spp. piuttosto che alla sua diffusione (EFSA,2009; EFSA, 2011; Nauta et al., 2009), scopo di questo studio, svolto dal Laboratorio di Diagnostica dell' Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Sezione di Fermo nell'anno 2017, è stato un approccio quantitativo al monitoraggio di Campylobacter spp. nei polli da carne al mattatoio e relativa tipizzazione molecolare.
Come sede di prelievo è stato scelto il mattatoio avicolo più rappresentativo della Regione Marche, presso il quale nel corso dell'anno sono stati prelevati, da ciascun lotto campionato, contenuti ciecali, pelle del collo e pelle del petto di polli da carne.
Tali campioni sono stati sottoposti a conta di Campylobacter spp., a tipizzazione molecolare, a analisi filogenetiche mediante Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) e Multilocus sequencing typing (MLST) e a studi di antibiotico resistenza.
Per l'analisi genotipica avanzata dei ceppi isolati dalle diverse matrici e dai diversi lotti di macellazione, ci siamo avvalsi della collaborazione del Laboratorio Nazionale di Riferimento del Campylobacter (IZSAM Teramo).
La costruzione dell'albero filogenetico, l'interpretazione delle correlazioni tra i ceppi, lo studio dell'antibiotico resistenza , nonchè la valutazione delle eventuali cross-contaminazioni o impatti legati al management degli allevamenti, sono ancora in corso.
La prospettiva futura per il 2018 sarà lo studio delle eventuali correlazioni filogenetiche tra i ceppi di Campylobacter spp. isolati in questi anni dai petti di pollo di lotti afferenti alle stesse aziende campionate al mattatoio nell'anno 2017 e i ceppi appunto isolati nel presente progetto.
La nostra attenzione sarà allo stesso modo rivolta all'ambito umano, al fine di ottenere un completo studio di correlazione filogenetica che comprenda ceppi isolati in allevamento, al mattatoio, nelle mense e dagli ospedali.
Lo studio
Negli anni 2015, 2016 e 2017 la sezione di Fermo dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche, in particolare il laboratorio di Diagnostica, ha concentrato la propria attività di Ricerca sul ruolo del laboratorio come elemento strategico di sorveglianza delle zoonosi focalizzando l'attenzione sulla valutazione e gestione del rischio della Campilobatteriosi.
Tale attività si è sviluppata aderendo nel 2015 al "Programma di Attività 2015 finalizzato alla realizzazione dell'Obiettivo Regione Marche One Health: potenziamento dei sistemi di sorveglianza delle malattie infettive emergenti (di interesse umano veterinario) a trasmissione vettoriale - Valutazione e gestione del rischio della Campilobatteriosi" (codice PAM32015), nel 2016 al "Programma di Attività 2016 finalizzato alla realizzazione dell'Obiettivo Regione Marche: Sorveglianza delle zoonosi: ruolo del laboratorio come elemento strategico della sorveglianza" (codice PAM22016) e nel 2017 al "Programma di Attività 2017 finalizzato alla realizzazione dell'Obiettivo Regione Marche: Sorveglianza delle zoonosi. Ruolo del laboratorio come elemento strategico della sorveglianza: gestione del rischio della Campilobatteriosi" (codice PAM22017) - Responsabile Scientifico Dott.ssa Marta Paniccià.
Le zoonosi sono malattie causate da agenti in grado di infettare uomo e animali, sia direttamente che indirettamente tramite alimenti, ambiente ed insetti vettori. Queste malattie hanno un impatto significativo per l'elevato numero di casi, per la gravità che possono assumere, ma anche per le perdite economiche di cui sono responsabili nei settori produttivi, nell'industria alimentare e nel settore zootecnico. Sono più di 200 le malattie classificabili come "zoonosi" e circa il 75% delle malattie emergenti e riemergenti in Europa negli ultimi 10 anni è stato trasmesso da animali o da prodotti di origine animale.
Ogni anno, in Europa vengono confermati più di 320.000 casi nell'uomo, sebbene il numero effettivo sia probabilmente di gran lunga più elevato a causa di sottonotifiche e dalla mancata diagnosi eziologica dovuta ad uno scarso ricorso ad accertamenti di laboratorio. La Commissione Europea (Direttiva 2003/99/CE) ha ufficialmente impegnato gli Stati Membri ad introdurre sistemi di sorveglianza più efficaci e coordinati, sottolineando l'importanza di raccogliere dati attendibili sull'incidenza delle zoonosi di origine alimentare e non.
Nell'ultimo report (EFSA 2015), relativo ai dati del 2014, la Campilobatteriosi risulta essere la zoonosi maggiormente diffusa con 236.851 casi umani confermati e 25 decessi, con costi elevati per il sistema sanitario e con perdita di produttività di circa 2.4 miliardi di euro all'anno.
In Italia i casi di campilobatteriosi confermati nell'uomo sono solamente 0.76/100.000 abitanti: questo dato testimonia probabilmente un problema di sottonotifica dei casi e la difficoltà nell'isolamento del patogeno. È noto che nella maggior parte delle regioni gli accertamenti diagnostici generici in caso di gastroenterite prevedono solamente la ricerca della Salmonella, impedendo così di accertare la presenza di altri patogeni. La carne di pollame cruda è spesso contaminata da Campylobacter spp., perché il batterio può vivere anche nell'intestino di esemplari sani. Si trova inoltre in suini e bovini. La più comune fonte di infezione è rappresentata dal consumo di carne di pollo poco cotta o di alimenti pronti al consumo che siano stati a contatto con carne di pollo cruda.
Tra i sintomi usuali figurano febbre, diarrea e crampi addominali.
La manipolazione attenta della carne cruda e di altri ingredienti alimentari crudi, una cottura accurata e una scrupolosa igiene in cucina possono prevenire o ridurre il rischio da cibi contaminati.
Per proteggere i consumatori da questa minaccia alla salute pubblica l'UE ha adottato un approccio integrato alla sicurezza alimentare che interessa l'intera filiera, dall'azienda agricola alla tavola. L'approccio consiste in misure di valutazione e di gestione del rischio, con la partecipazione di tutte le principali parti interessate: Stati membri dell'UE, Commissione europea, Parlamento europeo, EFSA e Centro europeo per la prevenzione e il controllo delle malattie (ECDC). L'approccio è sostenuto da attività tempestive ed efficaci di comunicazione del rischio.
Poiché per la Regione Marche non c'erano dati disponibili sulla diffusione del Campylobacter spp. nella filiera avicola, nei primi due anni del progetto (2015-2016) l'attività è stata volta alla valutazione della prevalenza del microrganismo negli allevamenti avicoli, tramite ricerca di Campylobacter spp. da tamponi cloacali, e alla individuazione dei fattori di rischio nell'ambito del management dell'allevamento correlati alla presenza dell'infezione, tramite la raccolta di dati anamnestici ed epidemiologici. Nel corso dell'anno 2017, vista l'introduzione del criterio di igiene di processo del Campylobacter spp. a modifica del Regolamento (CE) n. 2073/2005 ( Regolamento (UE) 2017/1495 della Commissione del 23 agosto 2017, da attuarsi a partire dal 1/01/2018), l'attività si è spostata su un approccio quantitativo volto alla individuazione della carica del patogeno nei polli da carne presso il più rappresentativo mattatoio marchigiano. Gli obiettivi specifici dell'attività svolta e in essere sono:
- valutare la prevalenza e la carica di Campylobacter spp. al mattatoio tramite il prelievo di contenuti ciecali, pelle del collo e pelle del petto;
- tipizzare con metodiche classiche e avanzate di biologia molecolare i ceppi isolati;
- ossevare l'eventuale correlazione filogenetica tra i ceppi;
- effettuare studi di antibiotico resistenza;
- produrre linee operative da applicare all'intera filiera avicola per ridurre eventuali cross-contaminazioni e migliorare il management aziendale.
Da ogni allevamento/lotto sono state prelevate, da un numero significativo di broiler, tre matrici: contenuto ciecale, pelle del collo e pelle del petto. Tali campioni sono stati sottoposti a numerazione di Campylobacter spp. (ISO10272-2:2006) presso il Laboratorio di Diagnostica IZSUM-Fermo. (Fig.1 e Fig.2)
Figura 1. Condizioni di crescita del Campylobacter spp.
Figure 1. Growth conditions of Campylobacter spp.
Figura 2. Conta Campylobacter spp. da contenuto ciecale
Figure 2. Campylobacter spp. counts from caecal content
Gli isolati, a seguito di conferma tramite prove biochimiche e colorazione di GRAM, sono stati tipizzati mediante PCR MULTIPLEX (identifica i ceppi C.coli, C. jejuni, C. lari, C. upsalientis, C. fetus) e stoccati in ceppoteca a -80°C. (Fig. 3 e Fig.4)
Figura 3. Mix e profilo termico della PCR Multiplex per Campylobacter, (Wang et al. 2002)
Figure 3. PCR Multiplex for Campylobacter; Mix and thermal profile, (Wang et al. 2002)
Figura 4. Corsa elettroforetica su gel d'agarosio (1,5%)
Figure 4. Electrophoretic run on agarose gel (1,5%)
Figura 5. PFGE Campylobacter jejuni - Enzima SmaI
Figure 5. PFGE Campylobacter jejuni - SmaI Enzyme
Ai fini del progetto è stata definita come azienda avicola positiva l'azienda sottoposta a prelievo presso il mattatoio selezionato e per la quale è risultato positivo almeno un campione all'isolamento. L'attenzione però è stata rivolta alle cariche delle diverse matrici e alla distribuzione delle diverse specie di Campylobacter intra e inter aziendale, confrontando i risultati con i criteri definiti dal Regolamento (UE) 2017/1495 della Commissione del 23 agosto 2017. (Tabella 1)
Dalle aziende selezionate per il campionamento è stata prevista la raccolta dei dati relativi ai fattori di rischio che sono stati correlati con la presenza del Campylobacter spp.; per alcuni di questi fattori sono state individuate le caratteristiche dagli archivi dell'Anagrafe Avicola Nazionale, per altri, si è proceduto alla raccolta dati presso le aziende stesse.
Table 1. Hygiene criteria of the Campylobacter process (modification of the regulation EU n. 2073/2005)
Il prossimo obiettivo sarà quello di raccogliere tutte le informazioni e i dati ottenuti in questi tre anni a partire da campionamenti effettuati negli allevamenti avicoli, al mattatoio, nei petti di pollo fino all'uomo.
L'attività da svolgere sarà incentrata sulla definizione delle eventuali correlazioni filogenetiche tra tutti i ceppi di C. coli e C. jejuni isolati, collaborando con il Laboratorio Nazionale di Riferimento del Campylobacter (IZSAM-Teramo) e armonizzando i risultati di PFGE, MLST e sequenziamento.
Vista la sempre crescente resistenza che i microrganismi dimostrano ai chemioterapici, continuerà a essere affrontato lo studio dell'antbiotico resistenza tramite l'allestimento delle MIC. Un albero filogenetico "farm to fork" rappresenterebbe linfa nuova per un approccio mirato sulla gestione della filiera e sulle strategie di intervento. Bibliografia
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| OPEN REVIEW - Modulo per la "revisione aperta" di questo articolo, pubblicato sul numero 106/2018 di SPVet.it |
Silenzi et al, 2018 - Studio di prevalenza, conta e tipizzazione molecolare di Campylobacter spp. nei broiler macellati nella Regione Marche (SPVet.it 106/2018)
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