Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 107, Aprile 2018 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
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Controllo di qualità dei vaccini stabulogeni prodotti presso l'Officina Farmaceutica, dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche, con metodi in vitro
In vitro methods for quality control of autogenous vaccines produced at the Zooprofilattico Sperimentale Institute of Umbria and Marche (Italy) Pharmaceutical Unit
Antonella Di Paolo, Katia Forti, Lucia Anzalone, Martina Pellegrini, Sara Corneli, Giulio Canonico, Giulio Severi, Monica Cagiola
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche "Togo Rosati", Perugia
Abstract.Endotoxins are high molecular weight complexes associated with Gram-negative bacteria; they are the most significant source of pyrogens in pharmaceutical water, raw materials, parenteral products, and medical devices. It is a real concern for regulatory agencies, manufacturers, and healthcare professional, thus the low amount or no presence of endotoxins is one of the most important goals. In fact, high levels of endotoxin can rise to a range of pathophysiological reactions and adverse effects following vaccination, as observed in in human and animals.
A recommended endotoxin limit <200 EU/mL for live attenuated human vaccines comes from the complex nature of multi-antigen vaccines, indeed limit <500 EU/mL is recommended for inactivated human vaccines (Brito e Singh, 2011).
On the strong hint of the 63/2010 EU Directive (Direttiva 2010/63/EU), which was transposed to Italy in 2014, Experimental Zooprophylactic Institute of Umbria and Marche (IZSUM) carried out an initial evaluation of vaccines produced at UODOF with new in vitro methods, where possible, alternative to the use of animals for quality test in pharmacological, cosmetic and research applications
Riassunto. Le endotossine sono complessi ad alto peso molecolare associati a batteri Gram-negativi; sono la fonte contaminante più significativa di pirogeni in acqua e materie prime utilizzate nell'industria farmaceutica, in prodotti parenterali e dispositivi medici. La presenza di endotossine rappresenta un problema rilevante per le agenzie regolatorie, per i produttori e per i professionisti del settore sanitario, e quindi una minore quantità o assenza di endotossine è uno degli obiettivi più importanti da perseguire. Infatti, elevati livelli di endotossine possono portare ad una gamma di reazioni fisiopatologiche ed effetti negativi dopo la vaccinazione, come osservato negli esseri umani e negli animali. In medicina umana il limite di endotossina raccomandato è <200 EU/mL per vaccini attenuati vivi e deriva dalla natura complessa dei vaccini multi-antigene, mentre per i vaccini umani inattivati è consigliato un limite di <500 EU/mL (Brito e Singh, 2011).
Sulla spinta della Direttiva 63/2010 della UE, recepita in Italia nel 2014, l'IZSUM ha effettuato una prima valutazione dei vaccini prodotti presso la UODOF con nuovi metodi in vitro, per renderli ove possibile, alternativi all'uso di animali nei controlli di qualità dei prodotti in ambito farmacologico, cosmetico e nella ricerca
Introduzione - Definizione della ricerca svolta
Il D.lgs. 4 marzo 2014, n. 26, recante attuazione della direttiva 2010/63/UE (Brito e Singh, 2011) sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici, all'art. 37 rubricato "Approcci alternativi", dispone che il Ministero promuova "lo sviluppo e la ricerca di approcci alternativi, idonei a fornire lo stesso livello o un livello più alto d'informazione di quello ottenuto nelle procedure che usano animali, che non prevedono l'uso di animali o utilizzano un minor numero di animali o che comportano procedure meno dolorose."
L'utilizzo di animali a fini scientifici o educativi riguarda principalmente tre aree: la ricerca biomedica, il controllo dei prodotti biologici e, attualmente in misura inferiore, le esercitazioni pratiche in ambito formativo. Gli animali da laboratorio svolgono un ruolo di primaria importanza nelle indagini di differente tipologia finalizzate alla protezione della sanità pubblica, del consumatore e dell'ambiente.
Nonostante il fermento da parte di ricercatori, ad oggi il numero dei metodi alternativi completamente validati ed ufficializzati non copre in maniera esaustiva tutti gli endpoint per la valutazione della sicurezza e dell'efficacia dei prodotti.
Esistono diversi modelli non animali (in vitro, in silico, in chemio), quotidianamente utilizzati o in fase di caratterizzazione nei laboratori di ricerca biomedici.
Queste tecnologie, ampiamente utilizzate come indagini preliminari di "screening", non rientrano al momento nell'area dei metodi alternativi ufficialmente riconosciuti, ma forniscono un importante serbatoio di conoscenze che potranno essere riconosciute a livello ufficiale in un prossimo futuro. In accordo alla normativa del 2014 sull'utilizzo di metodiche alternative alla sperimentazione animale, le finalità degli attuali progetti di ricerca sono quelle del "replacement, reduce and refine", ovvero di sostenere attività scientifiche e supportare la raccolta di dati sulla sperimentazione e su metodi alternativi sviluppati, proseguire con la formazione delle strategie finalizzate allo sviluppo e applicazioni di metodi alternativi.
Il progetto di ricerca (codice RFBR12016) ha coinvolto 13 unità operative tra i vari Istituti Zooprofilattici ed ha avuto il Laboratorio del Reparto Substrati Cellulari ed Immunologia Cellulare dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia-Romagna come capofila per lo sviluppo di metodiche alternative all'utilizzo di animali nella attività di diagnostica e di controllo dei prodotti biologici negli Istituti Zooprofilattici (IIZZSS).
L'attività svolta dall'Unità Operativa Dipartimentale Officina Farmaceutica di Perugia si è inserita nella Tematica n.1 - Standardizzazione produzione vaccini stabulogeni, controlli innocuità mediante test in vitro.
Definizione degli obiettivi
Messa a punto di metodi alternativi all'utilizzo di animali da laboratorio in riferimento alla prova di tossicità anormale su topino e/o cavia.
Valutazione di saggi di pirogenicità, obbligatori per tutte le soluzioni iniettabili, per la valutazione qualitativa e quantitative del livello di endotossine presenti nel vaccino. Attualmente, il test Limulus Amebocyte Lysate (LAL) rappresenta un saggio valido per la determinazione delle endotossine(42 FR 57749).
Questo test, sostenuto dalla Food and Drug Administration (FDA), può sostituire la prova su topino e/o cavia ed è raccomandato per la valutazione delle endotossine sui prodotti parenterali umani e veterinari, al fine di rispettare i limiti di endotossine stabiliti dalla Farmacopea Ufficiale.
Sintesi dei materiali e metodi
Nel corso delle attività di ricerca si sono valutati diversi lotti di vaccini stabulogeni veterinari diretti verso patogeni Gram positivi e Gram negativi, attraverso due metodiche distinte.
In vaccini contro patogeni appartenenti ai batteri Gram negativi è stata valutata la presenza di endotossine batteriche, in particolare lipopolisaccaride (LPS) della parete, attraverso il LAL test.
LAL test: base del test è la capacità degli amebociti estratti dal sangue di Limulus polyphemus (granchio a ferro di cavallo) di gelificare in presenza di endotossine batteriche provenienti da batteri Gram-negativi, responsabili dell'effetto pirogeno. Gli amebociti rappresentano le uniche cellule circolanti nel sangue del Limulus polyphemus; al loro interno, vi sono granuli contenenti una serie di enzimi attivabili a cascata. Il lisato degli amebociti (Limulus Amebocyte Lysate) è il reagente base del LAL test.
Le endotossine batteriche presenti nel campione in esame interagiscono con il lisato e, attivando la cascata enzimatica, causano la formazione del gel (da cui deriva il nome Gel Clot). Il reattivo LAL è stato messo in contatto con i vaccini pronto uso prodotti nel 2016 e soluzione di idrossido di alluminio al 20%, impiegato come adiuvante.
Monocite Activation test (MAT): in vaccini contro patogeni appartenenti al gruppo dei Gram positivi si è valutata la produzione di citochine pro-infiammatoria analogamente al Rabbit Pirogen Test (RPT), che misura l'innalzamento della temperatura (febbre) del coniglio in seguito a somministrazione del vaccino. Il test di attivazione monocitaria è stato effettuato in piastra, allestendo una fase di contatto tra il sangue intero di un coniglio senza reazione infiammatoria in corso e i vaccini/adiuvanti (Wunderlich et al., 2014).
Inoltre, le materie prime utilizzate per l'allestimento dei vaccini sono state saggiate come possibili fonti di contaminazione.
Discussione dei risultati e descrizione delle prospettive future derivanti dallo studio
Il LAL test condotto sui vaccini contro batteri patogeni Gram negativi ha dato esito positivo in tutti i lotti analizzati. In alcune prove, la formazione di Clot è stata evidenziata anche nei bidoni di plastica e nell'acqua utilizzata per la preparazione. Tale positività riscontrata è imputabile molto probabilmente a fonti esterne di contaminazione, come i betaglucani contenuti nelle pipette usa e getta, oppure alla tipologia di plastica dei bidoni adoperati per le preparazioni e che può attivare la gelificazione. Il contenuto di endotossine per i vaccini veterinari rilevati dalla ricerca condotta risultano molto inferiori a quelli disponibili in precedenti lavori (Brito e Singh, 2011).
Il test di attivazione monocitaria ha evidenziato un incremento della produzione delle citochine pro infiammatorie rispetto al sangue non stimolato. Questo dato ci ha indicato una nuova via di interpretazione, volta a stabilire la risposta in vitro alla somministrazione vaccinale. Anche in questo caso i pochi esperimenti condotti in ambito veterinario sono stati effettuati con kit ottimizzati in medicina umana e di difficile interpretazione.
Sulla base di questi risultati preliminari, gli obiettivi futuri sono volti ad ottimizzare e validare prove di tossico cinetica in vitro, stilare delle linee guida armonizzate per la valutazione qualitativa dei vaccini stabulogeni veterinari prodotti negli IIZZSS, infine dopo la validazione, applicare tali metodiche alternative come controlli di routine nella produzione dei vaccini.
Bibliografia
Brito L. A. O., Singh M. (2011). COMMENTARY: Acceptable Levels of Endotoxin in Vaccine Formulations During Preclinical Research" Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 100, no. 1, January 2011.
DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22nd September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes.
Licensing of Limulus Amebocyte Lysate, Use as an Alternative for Rabbit Pyrogen Test. (42 FR 57749, November 4, 1977).
Wunderlich C., Schumacher S., Kietzmann M. (2014). Pyrogen detection methods: Comparison of bovine whole blood assay (bWBA) and monocyte activation test (MAT). BMC Pharmacology and Toxicology 2014, 15:50.
Di Paolo et al, 2018 - Controllo di qualità dei vaccini stabulogeni prodotti presso l'Officina Farmaceutica, dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche, con metodi in vitro (SPVet.it 107/2018)
