Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 107, Aprile 2018 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
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Confronto fra gli esiti analitici della PCR e della FDC nelle infezioni sostenute da Chlamydophila abortus in allevamenti di ruminanti domestici del Centro Italia
Comparison between the analytical outcomes of the PCR and FDC in the infections by Chlamydophila abortus in domestic ruminants in the Central Italy
Jacopo Zema, Angela Caporali, Caterina Mariotti, Carmen Panzieri, Andrea Felici, Carmen Maresca, Silvia Crotti, Silva Costarelli
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche "Togo Rosati", Perugia
Abstract. Chlamydophila abortus (Cp. abortus) is one of the most common infectious bacteria causing abortion in pregnant sheep (Enzootic Abortion of Ewes - EAE), also responsible for infections in goats, cattle, pigs and humans. Abortion usually occurs 2-3 weeks before the end of gestation with the birth of dead or weak lambs. Routine diagnosis of Chlamydiosis is based on the detection of specific antibodies (indirect diagnosis) or by polymerase chain reaction (PCR) (direct diagnosis). The most widely accepted serological test is the complement fixation test (CFT) but recently a number of commercially enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) tests are available. The aim of this work was to verify if the CFT, used in our laboratories, can be still considered a valid indirect diagnostic technique for EAE. To this purpose, we compared the CFT and PCR results from samples of the same tested farms
Riassunto. Cp. abortus è la causa di Aborto Enzootico Ovino, malattia caratterizzata da aborti che si verificano prevalentemente durante le ultime settimane di gestazione. Gli animali colpiti possono anche portare a termine la gravidanza ma gli agnelli che nascono sono deboli, poco vitali e difficilmente sopravvivono oltre le 48 ore dal parto.
Oltre agli ovini, infezioni sostenute da Cp. abortus possono interessare anche altre specie come le capre, i bovini, i suini, i cavalli, alcuni ruminanti selvatici e l'uomo.
Nei ruminanti domestici la diagnosi di aborto sostenuto da Cp. abortus si basa sia su tecniche dirette (PCR), che sulla sierologia. Il test sierologico in uso presso i laboratori del nostro Istituto è la Fissazione del Complemento (FDC)
Negli ultimi anni tuttavia, in molti laboratori, la FDC è stata soppiantata dalla prova Elisa (Enzima Linked Immunosorbent Assay), più rapida e semplice da eseguire.
Con questo lavoro abbiamo voluto verificare se la FDC, in uso presso i nostri laboratori, può ancora costituire una valida tecnica di diagnostica indiretta e se le positività date dalla metodica trovano riscontro in una reale infezione all'interno dell'allevamento.
A tale scopo abbiamo valutato le possibili differenze tra i risultati ottenuti con il test di PCR e con la FDC negli stessi allevamenti sospetti di infezione
Introduzione
Chlamydophila abortus (Cp. abortus) è un microrganismo appartenente alle Chlamydiaceae, famiglia divisa in 2 generi sulla base delle sequenze analitiche del gene 16s e 23S (Everett et al., 1999) (Tab. 1).
Table 1. Classification of
chlamydias
Cp. abortus è la causa di Aborto Enzootico Ovino, malattia caratterizzata da aborti che si verificano prevalentemente durante le ultime settimane di gestazione (Longbottom e Coulter, 2003). Gli animali colpiti possono anche portare a termine la gravidanza ma gli agnelli che nascono sono deboli, poco vitali e difficilmente sopravvivono oltre le 48 ore dal parto.
L'aborto Enzootico è una patologia diffusa in larga parte del mondo, soprattutto nelle aree territoriali in cui l'allevamento ovino è molto praticato, aree in cui l'infezione tende ad assumere un carattere endemico con un impatto economico fortemente negativo.
Ai fini della diffusione ambientale del microrganismo, e quindi dell'infezione, l'aborto ed il parto sono gli episodi più importanti.
Il batterio, infatti, è presente in concentrazioni elevate nella placenta dell'animale infetto, nelle lochiazioni, nelle secrezioni vaginali, nei feti ovini abortiti.
I Corpi Elementari, che costituiscono la forma infettiva di Cp. abortus, sopravvivono bene nell'ambiente esterno, anche diversi giorni, in rapporto alle condizioni presenti (Aitken, 1990). Gli animali vergini si infettano per ingestione o per inalazione attraverso l'aerosol ambientale (Jones e Anderson, 1988). La via di trasmissione venerea ha un ruolo epidemiologico più limitato visto il mancato contatto tra i maschi e le femmine nel periodo più a rischio, cioè in quello dei parti (Appleyard et al., 1985).
La forma clinica varia in relazione allo stadio di gestazione: se l'infezione avviene precocemente (prima di 5-6 settimane dal parto) gli animali tendono ad abortire o a partorire feti poco vitali; al contrario, un'infezione contratta nelle ultime settimane di gravidanza può esitare in un parto regolare ma la femmina, latentemente infetta, abortisce nella successiva stagione dei parti (Aitken et al., 1990).
Cp. abortus penetra nei placentomi richiamando macrofagi, neutrofili, linfociti e plasmacellule. Il danno dell'epitelio coriale si estrinseca in un processo infiammatorio ed edematoso che, alterando gli scambi ematici materno-fetali, provoca la morte del feto e l'aborto. Anche altre dinamiche spiegano l'aborto: nella placenta danneggiata aumenta la produzione di citochine infiammatorie come IFNγ e TNFα e si alterano gli equilibri ormonali con una drastica riduzione di progesterone ed un aumento di prostaglandine (PGE2) ed estradiolo (Entrican G., 2002).
In un gregge indenne, colpito dall'infezione, gli episodi abortivi, inizialmente limitati, finiscono con il coinvolgere oltre il 30% delle femmine gravide. Nei greggi in cui l'AEO è endemico la percentuale di aborti si aggira intorno al 5-10% (Aitken., 1986).
Oltre agli ovini, infezioni sostenute da Cp. abortus possono interessare anche altre specie come le capre, i bovini, i suini, i cavalli, alcuni ruminanti selvatici e l'uomo (Shewen, 1980; Buxton, 1986). Cp. abortus, infatti, ha un importante carattere zoonosico e nelle donne gravide, a stretto contatto con animali infetti, si può registrare placentite ed aborto (Longbottom e Coulter, 2003).
Nei ruminanti domestici la diagnosi di aborto sostenuto da Cp. abortus si basa sia su tecniche dirette, ormai esclusivamente di tipo biomolecolare (PCR), che sulla sierologia. Il test sierologico in uso presso i laboratori del nostro Istituto è la Fissazione del Complemento (FDC) che permette, in caso di positività, di esprimere anche un titolo. La tecnica è stata descritta da Stamp and coll. nel 1952 ed è stata ampiamente utilizzata nei laboratori di tutto il mondo per decenni. Lo stesso Manuale OIE, benché aggiornato al 2012, identifica questa tecnica analitica come "the most widely used procedure for detecting infection".
Negli ultimi anni tuttavia, in molti laboratori, la FDC è stata soppiantata dalla prova Elisa (Enzima Linked ImmunoSorbent Assay), più rapida e semplice da eseguire.
Sia la FDC che l'Elisa non permettono di differenziare una positività dovuta alla presenza di anticorpi vaccinali o ad uno stato di infezione.
Con questo lavoro abbiamo voluto verificare se la FDC, in uso presso i nostri laboratori, può ancora costituire una valida tecnica di diagnostica indiretta e se le positività date dalla metodica trovano riscontro in una reale infezione all'interno dell'allevamento.
A tale scopo abbiamo valutato le possibili differenze tra i risultati ottenuti con il test di PCR e con la FDC negli stessi allevamenti sospetti di infezione.
Materiali e metodi
I dati sono stati presi dal Sistema Informatico di Gestione dei dati di Laboratorio (SIGLA) dell'Istituto valutando gli esiti legati alla diagnosi diretta ed indiretta.
Il periodo preso in considerazione va da gennaio 2015 a marzo 2017.
La popolazione coinvolta nello studio in oggetto è risultata costituita da allevamenti ovini, caprini e bovini.
L'analisi ha mirato a valutare la concordanza, o meno, tra i risultati ottenuti in PCR e quelli in FDC negli stessi allevamenti, nello stesso tempo. Sono state escluse le accettazioni in cui era stato richiesto solo uno dei due accertamenti analitici.
Gli allevamenti sono stati considerati positivi per le singole prove diagnostiche quando almeno uno dei campioni esaminati è risultato positivo alla PCR o alla FDC.
PCR: la ricerca di Chlamydia spp. viene eseguita attraverso una Real Time- PCR (RT-PCR), secondo il protocollo suggerito da Ehricht et al. (2006) (1), modificato dal laboratorio. La fase di amplificazione del DNA è preceduta da una estrazione dello stesso, attraverso l'utilizzo di un Kit commerciale (QIAGEN®), partendo da un pool di organi costituito da fegato, polmone e contenuto del IV stomaco del feto abortito, dalla placenta, nel caso in cui questa sia stata conferita al laboratorio, o da tamponi vaginali della femmina che ha abortito. Per l'estrazione del DNA si esegue il protocollo fluidi (o protocollo tamponi, a seconda della matrice di partenza), secondo le indicazioni fornite dalla ditta produttrice. Il risultato della PCR è espresso in positivo o negativo.
FDC: per la fissazione del complemento si utilizzano Emolisina, Complemento ed Antigene di ditte commerciali. L'antigene è rappresentato da un estratto purificato di corpi elementari e corpi reticolari di Cp. abortus e C. trachomatis. La soluzione di Globuli Rossi al 2% è allestita da sangue dei nostri montoni prelevato mensilmente in Alsever.
Per la FDC il risultato è negativo o positivo e le eventuali positività sono espresse per titolo. Titoli ≥ 1:32 sono considerati positivi. Il titolo è dato dalla più alta diluizione di siero che mostra il 50 % della reazione attesa, cioè di emolisi.
Per valutare eventuali differenze di titolo anticorpale ottenuto in FDC, tra allevamenti risultati positivi o negativi in PCR, è stato utilizzato il test di Mann Whitney; è stato considerato statisticamente significativo un valore di p ≤ 0,05.
Risultati
Delle 373 aziende saggiate, 306 hanno dimostrato una corrispondenza analitica tra FDC e PCR. In particolare: in 281 allevamenti entrambe le prove sono risultate negative; in 25 allevamenti: entrambe positive. In sintesi nell'82% degli allevamenti c'è corrispondenza tra diagnosi diretta e indiretta (Tab. 2).
I risultati discordanti (18%) si sono manifestati nel seguente modo:
1) 22 allevamenti PCR-/FDC +;
2) 45 allevamenti PCR +/ FDC -;
Table 2. Aggregate results for positive / negative of 2 tests
Table 3. Results with the FDC positive divided by dilution
Il grafico della figura 1 riporta il numero di allevamenti "FDC-positivi" divisi per titolo e il relativo risultato della PCR, in termini di PCR+ o PCR-.
Figura 1: Distribuzione dei positivi FDC a diverse diluizioni per risultato della PCR
Figure 1: FDC positive distribution at different dilutions by PCR result
Figura 2. Box plot delle diluizioni di FDC per esito PCR (escludendo i negativi FDC)
Figure 2. FDC dilutions Box plot, for PCR outcome (excluding FDC negatives)
Il test di Mann-Whitney ha evidenziato una differenza statisticamente significativa del titolo della FDC tra gli allevamenti PCR positivi e quelli PCR negativi (p-value < 0,001); in particolare si ha un valore mediano del titolo più basso per PCR negativa rispetto a quello che si registra per PCR positiva (Fig. 1 e Fig. 2)
Discussione e conclusioni
Nel 18% degli allevamenti da noi controllati con entrambe le metodiche diagnostiche, non si è registrata corrispondenza tra gli esiti della diagnostica diretta ed indiretta ma i risultati discordanti trovano facile spiegazione conoscendo le dinamiche della risposta anticorpale e delle pratiche di allevamento.
Esiti PCR+/FDC- possono essere motivati dal fatto che l'animale "abortito" non abbia ancora sieroconvertito. In sierologia la sieroconversione costituisce l'elemento diagnostico conclusivo ma purtroppo il secondo prelievo è quasi costantemente assente. L'approccio di questa indagine pecca, infatti, della mancata opportunità di valutare la sieroconversione ma il suo obiettivo vuole essere anche quello di verificare se, operando nelle normali condizioni di campo, cioè in assenza, spesso, di un secondo prelievo, le due tecniche analitiche insieme (FDC e PCR), abbiano sufficiente attendibilità ai fini diagnostici.
Inoltre, fare diagnosi di aborto infettivo richiede la disponibilità di materiale di ottima qualità. Un feto appena abortito, invogli fetali e tamponi vaginali freschi costituiscono le matrici di elezione su cui effettuare un esame batteriologico, virologico o accertamenti di tipo biomolecolare. Al contrario, spesso arriva materiale non prelevato direttamente dall'animale ma raccolto dal suolo; in questi casi non si deve sottovalutare l'ipotesi che eventuali positività in PCR siano dovute ad una contaminazione ambientale piuttosto che ad un reale stato di infezione.
Per motivare esiti PCR-/FDC+ occorre considerare il tempo che intercorre tra il fenomeno aborto ed il prelievo ematico: se il lasso di tempo è troppo lungo, infatti, l'agente infettante può risultare non più presente nelle matrici saggiate in PCR mentre l'animale ha già sviluppato la sua risposta anticorpale. Anche quando la tempistica sia adeguata, il veterinario di campo è spesso costretto ad operare in condizioni in cui, a volte, non c'è certezza della corrispondenza tra soggetto che ha abortito e quello che egli sottopone a prelievo, aspetto, questo, che può motivare anche esiti contraddittori PCR+ e FDC-.
Altra motivazione è legata al fatto che la FDC, facendo uso dell'antigene LPS di membrana comune a diverse specie di Clamidia, induce positività in caso di infezioni sostenute non solo da Chlamydophila abortus ma anche da Cp. pecorum, Cp. pneumonie, etc. Pertanto nei casi in cui la PCR adottata dal laboratorio sia specifica per Cp. abortus si può osservare mancata corrispondenza fra gli esiti delle due prove.
Negli ultimi anni la sierologia delle infezioni da clamidia ha fatto sempre più uso delle tecniche immunoenzimatiche.
I test Elisa sono rapidi e semplici da eseguire e, utilizzando antigeni sintetici della MOMP (major outer membrane protein), specifici per Chlamydophila abortus, presentano ottime performances di sensibilità e di specificità.
L'elisa è un test senz'altro utile per verificare "a screening" lo stato immunitario di un'azienda e la prevalenza intra-aziendale dell'infezione, se si effettua un campionamento congruo con l'obiettivo. Può risultare più difficile, invece, interpretare l'esito di un test elisa se viene utilizzato per una diagnosi individuale o di pochi soggetti ed in assenza del contributo della PCR. Di fronte ad un esito elisa positivo occorre capire se sia legato ad un'infezione in atto o pregressa o se possa trattarsi di un residuo vaccinale.
I risultati del test elisa vengono espressi qualitativamente: Positivo, Negativo, Dubbio (se il kit lo prevede). Alcuni kit Elisa, di ultima generazione, riportano nei protocolli di validazione, la correlazione esistente tra i valori S/P (Densità Ottica tra il Siero in esame ed il siero Positivo di riferimento) del loro metodo elisa ed i titoli ottenuti in FDC, correlazione che tuttavia non viene riportata nei Rapporti di Prova. Inoltre ogni kit ha il proprio cut off che dovrebbe essere riportato nella legenda del RdP come indicatore della positività ottenuta, come a suggerire il titolo.
La peculiarità della FDC è quella di esprimere la positività con un titolo ad "impatto immediato", cioè in grado di rendere il risultato di facile lettura, utile ad interpretare l'eventuale positività soprattutto qualora non sia stato possibile effettuare accertamenti in PCR. Normalmente si associano titoli elevati a vaccinazioni recenti o ad infezioni in atto, correlazione, quest'ultima, che è emersa anche dalla nostra indagine.
Nel nostro studio, infatti, il test di Mann-Whitney ha dimostrato una correlazione statisticamente significativa tra titoli di FDC elevati, ? 1:128, e la PCR positiva. Al contrario titoli compresi tra 1:32 ed 1:64 sono stati raramente correlati ad una diagnostica diretta positiva. In questi casi è possibile che infezioni pregresse, residui vaccinali o infezioni sostenute da specie di Clamidia diverse da C. abortus abbiano contribuito al risultato positivo della FDC (Donn et al., 1997).
Abbiamo voluto verificare se la Fissazione del Complemento possa ancora ritenersi affidabile nella diagnosi indiretta di infezioni sostenute da Cp. abortus visto che, ormai, la maggior parte dei laboratori diagnostici fa largo uso di metodiche Elisa. Alla luce di quanto desunto dal nostro "studio a ritroso" possiamo concludere che la FDC, una volta che sia standardizzata e validata, e una volta che il laboratorio sia dotato di personale altamente specializzato nella sua esecuzione, continua a costituire una valida tecnica sierologica ai fini della diagnosi di AEO. A parità dei costi analitici "grezzi" che hanno le due metodiche, Elisa e FDC, quest'ultima aiuta ad indirizzare la diagnosi, anche sul singolo animale, sulla base della valutazione della positività registrata. Ogni volta in cui il titolo risulti particolarmente alto, anche in assenza di un riscontro diagnostico di PCR, si hanno buone ragioni per ipotizzare che l'aborto sia da correlare ad un'infezione da C. abortus.
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Zema et al, 2018 - Confronto fra gli esiti analitici della PCR e della FDC nelle infezioni sostenute da
Chlamydophila abortus in allevamenti di ruminanti domestici del Centro Italia (SPVet.it 107/2018)
