Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 107, Aprile 2018 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
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Studio e controllo degli allergeni negli alimenti: valutazione e messa a punto di un metodo di conferma biomolecolare
Study and control of food allergens: evaluation and development of a confirmatory biomolecular method
Naceur Haouet, Cristina Rondini, Silvana Farneti, Maria Lucia Mercuri, Elisa Pierboni, Valeria Bazzucchi, Serena Altissimi
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche "Togo Rosati", Perugia
Abstract. The study granted by the Italian Ministry of health was aimed to develop an allergen confirmatory PCR-Real Time method, single and unique at national and international level that can be reliable, accurate and reproducible, but also simple and fast, and can ensure uniformity of controls. The objective was also to identify the possibility of quantifying allergens. Four of the major emerging allergens, two vegetables, soy and peanut, and two animals, crustacean and fish, were selected. The results lead to some interesting considerations that should be more extensively investigated
Riassunto. Il presente progetto di ricerca corrente finanziato dal Ministero della Salute è stato effettuato al fine di sviluppare un metodo di conferma in PCR-Real Time di allergeni alimentari, unico a livello nazionale ed internazionale che permetta una rilevazione con un certo grado di affidabilità, accuratezza e riproducibilità, ma anche semplice e veloce e che possa assicurare uniformità nei controlli. L'obbiettivo era anche quello di identificare la possibilità di quantificazione degli allergeni. Quattro dei maggiori allergeni alimentari sono stati selezionati, di cui due vegetali, soia e arachide, e due animali, crostacei e pesci. I risultati hanno portato ad alcune considerazioni interessanti che andrebbero maggiormente approfondite
Definizione della ricerca svolta
Lo sviluppo sempre maggiore di allergie alimentari nei paesi occidentali è causa di una grave preoccupazione per il consumatore. Infatti, si stima che le allergie alimentari interessino circa il 5% della popolazione infantile e il 3-4% di quella adulta, con un incremento sempre maggiore di quelle che colpiscono i bambini. L'aumento delle allergie, accompagnato dal mutamento delle condizioni allergologiche che vedono la mancata scomparsa con l'età di diverse allergie e lo sviluppo di altre, tipiche in giovanissima età, senza considerare la crescente comparsa di cross-reattività tra allergeni, ha portato a riconsiderare le strategie di difesa del consumatore. Si è pertanto assistito all'emanazione di leggi che impongono di riportare in etichettatura la presenza di diversi ingredienti responsabili di allergie. Nell'Unione Europea è attualmente vigente il Regolamento 1169/2011 che impone di dichiarare la presenza nel prodotto alimentare di 14 dei principali alimenti contenenti proteine allergeniche.
Le notifiche del sistema di allerta europeo (RASFF), riguardanti la presenza di sostanze allergeniche non dichiarate in etichetta sono sempre presenti ed in continuo aumento.
La contaminazione degli alimenti con i cosiddetti allergeni nascosti rappresenta al momento il rischio più frequente per i soggetti sensibili. Un allergene è considerato nascosto quando non viene dichiarato in etichetta e può inaspettatamente raggiungere il prodotto finale attraverso diverse vie. Ciò ha portato, a livello industriale, all'adozione di una dichiarazione costante di una possibile presenza di tracce di ingredienti allergenici, sebbene non compresi tra quelli elencati in etichetta, con il conseguente sviluppo di mancata fiducia da parte del consumatore.
La severità delle reazioni allergiche inoltre dipende non solo dalla sensibilità del soggetto ma, molto presumibilmente, anche dalla quantità introdotta.
Un valore massimo ammissibile rappresenterebbe a tal punto l'unica via percorribile, al pari di quanto attualmente in vigore per il glutine, tant'è che tale possibilità sta prendendo sempre più corpo a livello legislativo comunitario. Uno degli ostacoli maggiori è però rappresentato dalla mancanza di protocolli analitici quantitativi affidabili e riproducibili.
Sono pertanto necessari dei metodi di rilevazione e di quantificazione affidabili per gli allergeni presenti negli alimenti, per assicurare la conformità dell'etichettatura degli alimenti e migliorare la tutela del consumatore. Ad oggi, i metodi disponibili sono basati sulla rilevazione di proteine (con ELISA ed altri test immunochimici) o di DNA (mediante PCR) che vengono usati come soli metodi di screening, in mancanza di un'analisi di conferma. D'altra parte non esiste al momento un metodo ufficiale e lo scenario internazionale è caratterizzato dall'uso di approcci differenti, spesso basati su target diversi (rilevazione diretta dell'allergene tramite ELISA o analisi indiretta del DNA per scoprire la presenza/assenza dell'ingrediente allergenico nascosto).
Obbiettivi
Obbiettivo della ricerca è la messa a punto di un metodo di conferma degli allergeni, in PCR realtime. L'intento è di ottenere un metodo univoco da proporre a livello nazionale ed internazionale che possa essere affidabile, accurato e riproducibile ma anche semplice e veloce e che possa garantire una uniformità dei controlli sull'intero territorio. L'obiettivo è anche quello di individuare la possibilità di una quantificazione degli allergeni. Sono stati scelti quattro dei maggiori allergeni, di cui due vegetali, soia e arachide, e due animali, proteine dei crostacei e pesce.
La scelta dei crostacei risiede sull'interazione allergenica esistente con i molluschi acquatici, molluschi terrestri, insetti allo stadio larvale e acari. Quella del pesce è dovuta invece alla impossibilità, confermata dalla letteratura, di ottenere un metodo di rilevazione di altri allergeni animali, quali in particolare uova e latte, mediante la PCR. Si ricorda a tal proposito che la legislazione vigente a livello europeo (Regolamento UE 1169/2011) elenca quali allergeni animali solo uova, latte, crostacei, pesci e molluschi.
Sono stati inoltre confrontati i risultati dei metodi biomolecolari con quelli immunoenzimatici, al fine di valutare e confrontare i costi e i tempi analitici, per stabilire quali possano essere le metodiche migliori utilizzabili per uno screening.
Materiali e Metodi
Per la metodica immunoenzimatica, sono stati selezionati i kit, in base alle performances dichiarate e testati in laboratorio al fine di una ulteriore selezione.
Le performance considerate erano specificità, nei confronti in particolare di molecole affini, la sensibilità e limite di rilevabilità, aspetto di notevole importanza nel campo degli allergeni, l'accuratezza, intesa da un punto di vista sia qualitativo sia quantitativo, senza trascurare infine la semplicità d'uso e i tempi di esecuzione.
Per quanto riguarda le metodiche in PCR-Real time, per l'arachide sono riportati 11 allergeni e quelli classificati come maggiormente allergenici sono codificati dai geni Arah1, Arah2 e Arah3. Dalla bibliografia quelli maggiormente utilizzati come bersaglio sono Arah1 e Arah2. Sulle sequenze disponibili in banca dati (GenBank AF432231 e AY007229) e citate (Jiang et al., 2011; Zhang et al., 2015, Hird et al., 2003) sono state disegnate 2 paia di set di oligonucleotidi per Arah1 e 1 per Arah2 mediante il software Primer Express v3.0. Il set di primer e probe per Arah1 è stato studiato per essere marcato con il quencer TAMRA e MGB-NFQ; per Arah2, è stato acquisito il sistema di Hird et al. 2003, marcato in TAMRA ed è stato costruito un nuovo set marcato con MGB-NFQ. Infatti, le sonde marcate con MGB-NFQ consentono la costruzione di amplificati più corti, preferibili nell'analisi di matrici complesse dove il DNA va incontro a frammentazione.
Per la soia sono stati scelti 4 geni; il gene Gly m5 (Genbank FN807059.1), per ora mai utilizzato allo scopo; una β-conglicinina, conosciuta anche come 7S globulina, in particolare la subunità α (unica subunità altamente allergenica), sulla quale è stato costruito un sistema primer/probe (marcato al quercher con MGB-NFQ); l'altro gene selezionato è stato Gly m Bd 30 K (subunità della Gly m5), per il quale è stato adottato il sistema presente in bibliografia (Platteau et al., 2011), per il quale è stato studiato un nuovo sistema sulla sequenza con numero di accesso DQ324851.1 (GenBank) con sonda marcata in MGB-NFQ. Infine l'ultimo gene selezionato per la matrice soia, è stato il gene endogeno lectina, validato e accreditato, quindi già a disposizione per applicazioni in Fast PCR real-time.
Dai risultati ottenuti sono stati selezionati i sistemi più sensibili, che presentavano quindi il più basso Cq e LOD pratico (%).
La praticabilità, efficienza e validità di questi sistemi viene verificata mediante applicazioni a campioni commerciali e uno spike sample preparato in laboratorio.
Per rilevare la presenza di DNA di pesce e di crostaceo negli alimenti è stata messa a punto una reazione di Real Time PCR "in house" con primers e specifiche sonde a idrolisi, tipo TaqMan, desunte dalla letteratura. La ricerca bibliografica ha orientato alla scelta di due geni a localizzazione mitocondriale. Il gene 18S rRNA per il target "pesce" e il gene 16S rRNA per il target "crostaceo" (B.J. Herrero et al. 2014; J.L. Brzezinski et al. 2005; B.J. Herrero et al. 2012). Le sequenze di ciascun gene nelle diverse specie di pesce/crostaceo, ottenute dal National Center of Biotechnology Information (NCBI) sono state allineate con Clustal W, integrate in Bioedit 7.0 e utilizzate per disegnare, per ciascun gene, uno specifico set di primers/sonda tramite il software Primer Express (Applied BioSystem). La sonda per il sistema di rilevazione "pesce" è marcata al quencer con MGB-NFQ e come fluoroforo impiega all'estremità 5' 6-FAM, per il sistema "crostaceo" è stata impiegata una sonda a LNA (Locked Nucleic Acid) con modifica interna con dInosina, marcata al quencer con BHQ-1 e al 5'con 6-FAM.
Risultati e prospettive future
I Kit ELISA selezionati sono risultati rapidi e di facile esecuzione e mostrano delle performances estremamente elevate, in termini di limite di rilevabilità, specificità, sensibilità ed accuratezza. Le curve in matrice hanno restituito ottimi risultati che hanno permesso di quantificare con maggiore esattezza le concentrazioni.
L'attività svolta nell'ambito del progetto ha consentito la messa a punto di quattro metodi in PCR Real Time per la ricerca degli allergeni "soia", "arachide", "pesce" e "crostaceo" negli alimenti.
Il punto di partenza per lo sviluppo di un metodo in biologia molecolare è ottenere un target (in questo caso DNA genomico) purificato da eventuali inibitori, qualitativamente e quantitativamente adatto per le successive analisi. Il confronto tra i metodi di estrazione del DNA ha indotto a preferire quelli con un campo di applicazione più ampio.
Da questo primo approccio sperimentale è stato possibile confermare le potenzialità della PCR Real Time come strumento di supporto per la ricerca degli allergeni negli alimenti.
Inoltre, le prove di allestimento di curve in matrice, hanno permesso un buono approccio per una possibile quantificazione. Infine, l'uso di PCR digitale ha dato risultati promettenti sia per una possibile analisi quantitativa, sia per uno screening simultaneo di numerosi target.
Questo progetto rappresenta infine il primo passo per l'individuazione del metodo di conferma migliore da adottare e pone il presupposto di una fase ulteriore a livello chimico.
I risultati permetteranno ai laboratori deputati al controllo degli allergeni di ottenere un metodo univoco per la ricerca ed eventuale quantificazione degli allergeni. In alternativa, tale metodo potrebbe essere trasferito ad un unico laboratorio centralizzato a livello nazionale, oppure all'organo deputato all'analisi di revisione o ancora ad un futuro centro/laboratorio di referenza per gli allergeni. La possibilità di una quantificazione d'altra parte potrebbe permettere di giungere, in un breve futuro, ad un limite massimo ammissibile. La quantificazione di tale limite potrebbe consentire di ottenere un maggiore livello di fiducia da parte del consumatore, in quanto rappresenterebbe un parametro oggettivo e permetterebbe di eliminare la voce ormai "spalmata" a quasi tutti i prodotti alimentari "può contenere tracce di allergeni".
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Haouet et al, 2018 - Studio e controllo degli allergeni negli alimenti: valutazione e messa a punto di un metodo di conferma biomolecolare (SPVet.it 107/2018)
