Futuri inquinanti organici persistenti della Convenzione di Stoccolma: gli Esabromociclododecani. sviluppo di un metodo multi-residuo ed indagine tossicologica

Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 109, Agosto 2018 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581

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Futuri inquinanti organici persistenti della Convenzione di Stoccolma: gli Esabromociclododecani. sviluppo di un metodo multi-residuo ed indagine tossicologica
Future Persistent Organic Pollutants (POPs) of the Stockholm Convention: The Hexabromocyclododecans (HBCDDs). Development of a multi-residue method and toxicological investigation

Arianna Piersanti, Tamara Tavoloni, Arianna Stramenga, Valentina Bardeggia, Eleonora Bastari, Eleonora Pavoni, Roberta Galarini, Simone Moretti, Giorgio Saluti, Rosanna Rossi, Monia Perugini

Istituto Zooprofilattico Sperimentale Umbria e Marche, "Togo Rosati", Perugia.

Abstract. BFRs are substances added to plastics, textiles and other materials to reduce flammability; they comprise a diverse variety of brominated organic compounds used to ensure that manufactured goods comply with fire safety regulations. Hexabromocyclododanes (HBCDs) were mainly used in building sector in the expanded polystyrene used as insulator. They have been also extensively applied in textile industry for the production of cotton or synthetic fibers (Covacci et al., 2006; EFSA 2011). Their chemical structure is a cyclic aliphatic hydrocarbon in which six hydrogen atoms are replaced by bromines. The HBCDs commercial mixture is predominantly composed of 3 stereoisomers: γ-isomer (72-90%), followed by α - (13%) and finally by β-HBCDs (<0.5-12%). δ- and ε-HBCD isomers can also be present (EFSA 2011). Like all BFRs, HBCDs are added without linking them to the polymer by chemical bonds, that is the reason why they are easily released into the environment, not only during the production and disposal, but also during use. The widespread of these substances brought to the contamination of all the environmental compartments so that now they are detectable in soils, sediments, biota and also in human biological fluids. In the last amendment of the Stockholm Convention (2013), HBCDs have been included in the list of persistent organic pollutants (POPs) which use should be restricted. The present project aimed to produce a validated method for the determination of the three α-, β- and γ-HBCD isomers in food, in order to have a tool to monitor the low background levels. A reliable and validated analytical method allows to implement monitoring plans and therefore to collect extensive and detailed information on HBCDs contamination levels and therefore on human exposure through diet. Toxicological studies on zebrafish embryos have been carried out within the project in order to obtain information on the potential flame-retardants toxicity, in particular regarding the biological effect and acute toxicity (CL50) of HBCDs

Riassunto. I Ritardanti di Fiamma Bromurati (BFRs) sono sostanze che vengono aggiunte in qualità di additivi a manufatti e prodotti di largo consumo per ridurne l'infiammabilità. Svariate sono le classi di composti chimici annoverati tra i BFRs, tra cui gli Esabromociclododecani (HBCDs). Essi hanno trovato principale impiego nel settore dell'edilizia, come additivi del polistirene espanso e sono stati anche ampiamente utilizzati nell'industria tessile, nella produzione delle tappezzerie in cotone o in materiale sintetico (Covacci et al., 2006; EFSA 2011). La struttura chimica degli HBCDs è costituita da un idrocarburo alifatico ciclico a dodici atomi di carbonio in cui sei atomi di idrogeno sono sostituiti da atomi di bromo. La miscela commerciale degli HBCDs è costituita prevalentemente da 3 stereoisomeri: l'isomero predominante è il γ - (72-90%), seguito dall' α - (13%) e dal β -HBCDs (<0.5-12%). Possono inoltre essere presenti in minima parte anche gli isomeri δ - e ε -HBCDs (EFSA 2011). Come tutti i BFRs, gli HBCDs sono utilizzati come additivi, pertanto vengono aggiunti al polimero senza essere legati chimicamente ad esso e proprio per questo motivo vengono facilmente rilasciati nell'ambiente anche durante l'utilizzo dei prodotti che li contengono. L'ampio e diffuso impiego di queste sostanze a livello mondiale ha fatto sì che essi abbiano contaminato tutti i comparti ambientali e siano oggi rilevabili nei terreni, nei sedimenti, nel biota e anche nei fluidi biologici umani. A seguito della loro persistenza nell'ambiente, alla loro capacità di bioaccumulo negli organismi e di biomagnificazione nella catena trofica gli HBCDs dal 2013 sono stati inclusi nella lista degli inquinanti organici persistenti (POPs) della Convenzione di Stoccolma. Nel 2011 l'EFSA (European Food Safety Authority) ha pubblicato un'opinione scientifica con lo scopo di raccogliere tutte le informazioni disponibili sugli HBCDDs, per quanto concerne i livelli di contaminazione degli alimenti, le tecniche analitiche, le possibili sorgenti, la tossicità ed il rischio per l'uomo in seguito ad esposizione con gli alimenti; in tale report non ci sono dati che riguardano l'Italia, a dimostrazione di come nel nostro Paese esista attualmente una lacuna di conoscenze. Con la Raccomandazione EC/118/2014, la Commissione Europea ha richiesto agli Stati Membri di attuare, nel biennio 2014-2015, un monitoraggio della presenza di BFRs, tra cui gli HBCDs (isomeri α-, β- e γ-), negli alimenti. Nella Raccomandazione veniva espressamente richiesto che i metodi analitici utilizzati avessero un limite di quantificazione pari od inferiore a 0.01 ng/g. Il lavoro svolto nell'ambito di questo progetto aveva come scopo quello di produrre un metodo validato per la determinazione dei tre isomeri α-, β- e γ-HBCD negli alimenti, utilizzabile per il monitoraggio dei bassi livelli di background. Un metodo analitico affidabile e validato consente di implementare piani di monitoraggio e quindi di avere informazioni estese e dettagliate sulla contaminazione da HBCDs e sull'esposizione alimentare dell'uomo a queste sostanze. Nell'ambito del progetto sono inoltre stati effettuati studi tossicologici su embrioni di zebrafish al fine di ottenere informazioni circa la potenziale attività tossica dei ritardanti di fiamma, in particolare riguardo all'effetto biologico e alla tossicità acuta (CL50) degli HBCDs

Definizione della ricerca svolta
Nell'ambito di questo progetto di ricerca è stato messo a punto un metodo analitico per la determinazione dei livelli di "background" dei tre isomeri α-, β- e γ-HBCD negli alimenti. I tre isomeri considerati sono stati definiti dall'EFSA come i più rilevanti per la stima della contaminazione degli alimenti.
L'analisi strumentale è stata inizialmente implementata in gascromatografia (GC) utilizzando come rilevatore uno Spettrometro di Massa Triplo Quadrupolo. E' noto dalla letteratura che l'applicazione della gascromatografia all'analisi di questa classe di analiti presenta dei limiti; infatti essa non consente di separare i 3 stereoisomeri α-, β- e γ-HBCD il cui risultato può essere espresso unicamente come somma [Covacci et al., 2007; Abdallaha et al., 2008].

I risultati ottenuti dallo sviluppo del metodo analitico mediante analisi in GC-MS/MS non sono stati completamente soddisfacenti, forse anche a causa dell'impossibilità di separare i tre isomeri. Infatti la quantifica delle tre molecole come somma ha impedito di ottenere risultati accurati. In un secondo momento si è deciso, pertanto, di implementare il metodo in LC-MS/MS, tecnica che consente la separazione cromatografica dei tre isomeri, permettendo di ottenere delle performances analitiche migliori di quelle ottenute in GC-MS/MS. Dopo aver ottimizzato opportunamente le condizioni strumentali, sono state effettuate prove per la messa a punto del metodo di preparativa, partendo dal metodo già validato dal laboratorio per la determinazione di un'altra classe di ritardanti di fiamma: i polibromodifenileteri (PBDEs) [Piersanti et al., 2015-2017].

Il metodo è stato modificato per massimizzare i recuperi degli HBCDDs, ridurre i possibili interferenti ed ottimizzare i tempi di analisi ed il consumo di solventi; in fine esso è stato sottoposto a validazione effettuando prove ripetute su un campione di muscolo di pollo fortificato a quattro differenti concentrazioni: 10, 20, 50 e 100 pg/g di ciascuno dei tre isomeri di HBCDs. La validazione è stata svolta in condizioni di riproducibilità intra-laboratorio: sono stati effettuati complessivamente 53 esperimenti indipendenti in 4 giornate. Il metodo ha fornito risultati accettabili sia in termini di precisione che di accuratezza.
Nell'ambito della validazione sono state anche effettuate prove di specificità per verificare l'applicabilità del metodo a tessuti diversi dal pollo. Sono stati pertanto analizzati in doppio campioni naturalmente contaminati di muscolo bovino, cozze e muscolo di pesce (tonno). Per tutte le matrici testate si sono ottenuti risultati soddisfacenti sia in termini recupero dei marcati α- e γ-HBCD-¹³C₁₂ (standard surrogati), che per quanto riguarda la qualità del tracciato cromatografico.
Nella messa a punto del metodo analitico si è tenuto conto delle problematiche di contaminazione ambientale che esistono nell'ambito dell'analisi dei BFRs, a causa del loro largo utilizzo e della loro diffusione ubiquitaria. E' stato implementato pertanto un rigoroso sistema di decontaminazione della vetreria e delle superfici di lavoro e, nello sviluppo del metodo di preparativa, sono state modulate opportunamente le modalità di estrazione e purificazione per raggiungere il giusto compromesso tra pulizia del campione, recupero degli analiti e controllo della contaminazione di fondo. Nonostante il metodo vada sottoposto ad ulteriori prove di validazione per poter essere esteso ad altre tipologie di alimenti, rappresenta comunque un ottimo punto di partenza per intraprendere un monitoraggio dei livelli di questa classe di contaminanti negli alimenti. Sarà così possibile iniziare a raccogliere dati ed informazioni in un settore in cui, soprattutto in Italia, poco è ancora stato fatto.

Per quanto concerne gli studi tossicologici il lavoro svolto nell'ambito del progetto si proponeva di raccogliere dati relativamente alla tossicità dei singoli isomeri di HBCD. Sono pertanto stati effettuati test di tossicità acuta utilizzando embrioni di zebrafish (Danio rerio) nelle prime fasi di sviluppo. Questa specie di teleosteo viene ampiamente impiegato nella ricerca in ambito tossicologico in quanto presenta omologie genetiche e fisiologiche con l'uomo superiori all'87%. In questo progetto per la stima degli effetti tossici letali, è stato utilizzato il "Fish Embryo Toxicity" (FET) Test, mentre gli effetti sub-letali sono stati valutati mediante lo studio delle alterazioni istopatologiche.
Nell'esecuzione del FET-test sono state valutate per ciascuno dei 3 isomeri 6 differenti concentrazioni (0,0001 mg/L, 0,001 mg/L, 0,01mg/L 0,5 mg/L, 1 mg/L e 2mg/L); i risultati ottenuti hanno evidenziato che a queste concentrazioni nessuno dei 3 isomeri α-, β- e γ - HBCDs ha causato nell'embrione lesioni apicali, e non ha pertanto avuto effetti di tossicità acuta. Si è ipotizzato che le sostanze somministrate non fossero entrate in contatto diretto con l'embrione per effetto del corion, una membrana di rivestimento che ricopre l'embrione nelle prime fasi dello sviluppo. I tests sono pertanto stati ripetuti utilizzando embrioni "nudi" (cioè decorionizzati) ottenendo però gli stessi risultati. È stata confermata quindi per tutti e tre i composti l'assenza di lesioni di tipo letale alle concentrazioni testate.

A conferma dei risultati ottenuti gli embrioni di zebrafish sopravvissuti ai FET tests, apparentemente sani sono stati sottoposti ad esame istopatologico andando a valutare eventuali alterazioni a carico del sistema nervoso, del cuore e del fegato. Al fine di una valutazione approfondita degli effetti tossici delle sostanze esaminate, sono state prese in esame anche le alterazioni sub-letali e le malformazioni che presentavano gli embrioni al termine del periodo di osservazione. Queste rilevazioni, non essendo alterazioni di letalità, non sono state considerate nella valutazione dei risultati finali degli effetti tossici acuti degli HBCDs, ma hanno fornito informazioni aggiuntive rispetto alla loro capacità di alterare la normale omeostasi nelle primissime fasi di vita.

Descrizione degli obiettivi della ricerca
Gli obiettivi della presente ricerca sono riportati di seguito:

Sviluppo di un metodo multi-residuo che consenta di determinare i tre stereoisomeri α-, β- e γ-HBCDD e mediante GC-MS/MS.
Validazione del metodo secondo un protocollo che tenga conto delle prescrizioni normative vigenti nel settore dei contaminanti organici persistenti e della Raccomandazione (2014/118/UE).
Studio del comportamento tossicologico dei tre stereoisomeri α-, β- e γ-HBCDD su embrioni di zebrafish indagando i possibili effetti additivi e sinergici.

Lo sviluppo di un metodo analitico per la determinazione degli HBCDDs e la sua validazione nell'ambito del campo di applicazione è un'attività necessaria e preliminare all'implementazione di piani di campionamento ufficiali di controllo degli alimenti a livello nazionale come ad esempio il Piano Nazionale Residui (PNR).
I risultati ottenuti potranno essere forniti all'EFSA per successive rielaborazioni e potrebbero contribuire alla definizione di limiti massimi di residuo nell'ambito di Regolamenti Europei. Sarà così possibile iniziare a raccogliere dati ed informazioni in un settore in cui, soprattutto in Italia, poco è ancora stato fatto.

I risultati degli studi effettuati sugli embrioni di zebrafish contribuiscono a raccogliere informazioni su queste sostanze anche dal punto di visto tossicologico, che allo stato attuale sono piuttosto scarse.

Sintesi di Materiali e Metodi
Sviluppo del metodo analitico per la determinazione degli HBCDs

Preparazione del campione
Il metodo analitico in diluizione isotopica è stato messo a punto e validato per le matrici muscolo di animale terrestre, pesce e prodotti della pesca.
- Estrazione
  20 g di campione omogenato vengono pesati in tubo da centrifuga in polipropilene da 50 mL. Dopo fortificazione con 1 ng degli HBCDs marcati utilizzati come standard surrogati (α- e γ-HBCD-¹³C₁₂), viene effettuata un'estrazione tipo QuEChERS con acqua ultrapura ed acetato di etile in presenza di cloruro di sodio e magnesio solfato anidro (Kalachova et al., 2011). Il campione viene quindi centrifugato a 4000 rpm per 10 min e la fase organica prelevata e trasferita in una provetta in vetro da 15 mL. Il solvente viene evaporato in centrifuga evaporante.
- Purificazione
  L'estratto viene ripreso con n-esano e caricato su una colonnina Extrelut-NT3 acidificata con acido solforico, collegata in testa ad una colonnina SPE di silice. Le due colonnine vengono eluite con esano e successivamente con una miscela di esano:DCM (2:1 v/v). L'eluato raccolto viene evaporato sotto flusso di azoto ad una temperatura di 40°C. Il campione viene quindi ripreso con 2 mL di miscela ciclo-esano/diclorometano (1/1, v/v) e sottoposto a purificazione GPC (Gel Permeation Chromatography) su colonna impaccata Bio-Beads S-X3 (500 mm x 10 mm).
Condizioni strumentali
Le prime analisi strumentali in GC-MS/MS sono state effettuate utilizzando un Gas cromatografo interfacciato ad uno spettrometro di massa triplo quadrupolo. Dieci µL di estratto vengono introdotti in un iniettore a temperatura e pressione programmabile (PTV) in modalità solvent vent. L'analisi cromatografica è stata effettuata su colonna capillare RTX-1614 da 15 m x 0.25 mm x 0.10 m. Per l'analisi strumentale in LC-MS/MS è stato utilizzato un HPLC accoppiato a spettrometro di massa ibrido triplo quadrupolo/trappola ionica. La cromatografia è stata messa a punto su colonna Kinetex XB-C18. La separazione cromatografica è stata ottimizzata lavorando in gradiente usando come fasi mobili MeOH (fase A) e una soluzione di acquosa di CH₃COONH₄ e MeOH (fase B).
Validazione del metodo
Poiché attualmente l'Unione Europea non ha fissato limiti per gli HBCDs negli alimenti, il piano di validazione del metodo è stato stilato tenendo conto dei livelli di contaminazione naturale desumibili da dati letteratura. Nell'ambito della valutazione delle performances del metodo analitico sono stati studiati i seguenti parametri:
- Linearità La linearità di risposta del detector è stata studiata mediante una taratura multi-punto in diluizione isotopica. A tale scopo, soluzioni standard a concentrazioni crescenti dei 3 isomeri α-, β- e γ-HBCD (0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 ng/mL e dei 3 HBCDs-¹³C₁₂ (2.0 ng/mL)) sono state iniettate in LC-MS/MS in tre giorni diversi.
- Accuratezza e Precisione
  Analisi ripetute su un campione di muscolo di pollo fortificato a quattro diversi livelli di concentrazione (10, 20, 50, 100 pg/g) sono state effettuate in condizioni di riproducibilità inter-laboratorio, per un totale di 53 determinazioni indipendenti. L'applicabilità del metodo ad altre matrici è stata studiata effettuando prove di specificità su muscolo bovino, tonno e mitili.

Studio tossicologico: FET Test
In questo studio sono stati valutati, tramite i Fish Embryo Acute Toxicity (FET) test, gli effetti acuti/subacuti dei tre isomeri di HBCDs (α-, β- e γ- HBCDs). Il metodo si basa sulla valutazione degli effetti letali di sostanze chimiche in embrioni di pesci. Tale approccio sostituisce i tests che utilizzano forme giovanili o adulte, che invece implicano una sperimentazione animale. Gli embrioni di zebrafish (Danio rerio), infatti, utilizzati nelle primissime fasi post fertilizzazione, non sono capaci di alimentarsi in maniera autonoma e quindi non sono contemplati nella normativa in vigore sull'uso degli animali ai fini scientifici.

Il principio del test si fonda sull'esposizione di singole uova di Danio rerio poste in micropiastre da 24 pozzetti per valutare l'eventuale effetto letale della sostanza in esame. Il test, eseguito entro 1 ora post fertilizzazione (hpf) e non oltre le 3 hpf, ha avuto una durata di 96 h. Gli effetti letali sono stati valutati tramite osservazioni giornaliere tra gli embrioni esposti e il controllo, al fine di determinare la CL50, NOEC e LOEC. Il metodo si è basato sull'uso di almeno 5 concentrazioni della sostanza indagata cui sono stati aggiunti un controllo positivo ed un controllo negativo. Per ogni concentrazione e controllo sono stati esposti 20 embrioni; ogni sostanza è stata testata parallelamente in tre repliche indipendenti.

Procedura FET test
Per l'allestimento del test è stato necessario utilizzare embrioni compresi tra 1 hpf e 3 hpf (embrione costituito da 16 cellule). Il test è stato condotto con 6 concentrazioni per i singoli isomeri ai quali sono stati aggiunti un controllo positivo (C+), costituito da 3,4-dichloroanilina alla concentrazione di 4 mg/L e un controllo negativo (C-), rappresentato dalla DW. Per ogni concentrazione e controllo sono stati esposti 20 embrioni. In seguito all'accoppiamento degli adulti, le uova sono state prelevate e immediatamente pre-trattate in beakers con gli standards delle sostanze alle concentrazioni di esposizione.
Una volta valutata, con stereomicroscopio, l'avvenuta fecondazione e l'assenza di alterazioni di forma e di struttura, le uova embrionate sono state esposte singolarmente in 2 mL di test solutions, costituita dalla concentrazione desiderata del congenere o miscela da testare diluita in DW; per permettere la solubilità dei PBDE in DW è stato aggiunto il DMSO alla concentrazione di 0,01%.
Ogni piastra presentava un controllo interno (CI) costituito da 4 embrioni, per consentire il confronto immediato con gli embrioni esposti. Le micropiastre, una volta allestite, sono state incubate a 26 ± 1°C per 96 ore con ciclo luce-buio di 14/10. Le soluzioni messe a contatto con gli embrioni sono state rinnovate ogni 24 h. Gli effetti letali sono stati determinati, per confronto con i controlli, tramite osservazioni giornaliere. I quattro effetti letali (end-point) presi in considerazione per la valutazione della prova sono stati:
- Coagulazione dell'embrione: questa alterazione, riconoscibile macroscopicamente grazie ad una colorazione bianco lattescente dell'uovo, all'osservazione microscopica si presenta con margini non definiti e colorazione nerastra dell'embrione. La coagulazione può verificarsi anche entro poche ore dall'inizio dell'esposizione e indica un effetto tossico acuto generico.
- La mancanza di formazione dei somiti: i somiti dovrebbero essere visibili dopo 12 hpf. A 24 hpf, alla temperatura di incubazione di 26 ± 1°C, in embrioni con un normale sviluppo, dovrebbero essere presenti 20 somiti; se assenti, l'embrione non si svilupperà ulteriormente e andrà incontro a morte.
- Il mancato distacco della coda: il distacco della coda dal tuorlo si osserva dopo 24 hpf, determinando un allungamento posteriore del corpo embrionale; questo fenomeno indica un normale sviluppo del pesce e può essere osservato a partire dalle 24 h di esposizione.
- Assenza di battito cardiaco: il battito è facilmente rilevabile dopo 48 hpf, la sua assenza indica la morte dell'embrione. Non sono stati considerati effetti letali le frequenze irregolari e l'assenza di circolo ematico in presenza di battito.
Esame istopatologico
L'esame istopatologico è stato condotto su embrioni di zebrafish al fine di confermare le osservazioni rilevate con i FET tests. Lo studio ha consentito la valutazione delle alterazioni nei principali organi interni; è stata soffermata l'attenzione alle lesioni a carico del sistema nervoso, del cuore e del fegato in quanto organi maggiormente coinvolti in seguito all'esposizione ai HBCDs.
Per l'esecuzione delle indagini istologiche sono stati utilizzati embrioni di zebrafish sopravvissuti ai FET tests, apparentemente sani. Gli embrioni sono stati prelevati casualmente dal gruppo di 20 embrioni utilizzati per la sperimentazione al termine delle osservazioni microscopiche (96 h) per la valutazione della tossicità acuta.
Sono stati prelevati 3 campioni per ciascuna concentrazione e congenere saggiato.

Descrizione delle prospettive future derivanti dallo studio
Il metodo sviluppato nell'ambito di questo lavoro permette la determinazione dei livelli di contaminazione di "background" dei 3 stereoisomeri α-, β- e γ-HBCDD, definiti dall'EFSA come i più rilevanti per la stima della contaminazione degli alimenti. Il metodo strumentale è stato inizialmente sviluppato in GC-MS/MS, ma l'impossibilità di separare i tre stereoisomeri con questa tecnica analitica ha fornito risultati non completamente soddisfacenti sia in termini di accuratezza che di riproducibilità. In un secondo momento è stato implementato il metodo in LC-MS/MS, ottenendo risultati decisamente migliori.

Nella messa a punto del metodo analitico si è tenuto conto delle problematiche di contaminazione ambientale che esistono nell'analisi dei ritardanti di fiamma bromurati, legati principalmente al loro largo utilizzo ed alla diffusione ubiquitaria. Per questo motivo è stato messo a punto un rigoroso protocollo di decontaminazione della vetreria e delle superfici di lavoro e, nello sviluppo del metodo di preparativa, sono state modulate opportunamente le modalità di estrazione e le fasi di purificazione per raggiungere il giusto compromesso tra pulizia del campione, recupero degli analiti e controllo della contaminazione di fondo.

La validazione a cui il metodo è stato sottoposto ha fornito risultati soddisfacenti sia in termini di precisione che di accuratezza. Nonostante ulteriori prove di validazione debbano essere condotte per poter estendere la procedura ad altre tipologie di alimenti, essa rappresenta comunque un ottimo punto di partenza per effettuare un monitoraggio dei livelli di HBCDs negli alimenti. Sarà così possibile iniziare a raccogliere dati ed informazioni in un settore in cui, soprattutto in Italia, poco è ancora stato fatto.
I risultati dell'indagine tossicologica effettuata su embrioni di zebrafish si sono rivelati estremamente interessanti, in quanto hanno mostrato come gli HBCDs alle concentrazioni saggiate non hanno determinato effetti acuti mentre hanno determinato soprattutto alterazioni di tipo sub-acuto e, probabilmente, teratogeno, fornendo informazioni rilevanti rispetto alla capacità di queste sostanze di alterare la normale omeostasi anche nelle primissime fasi di vita. Lo studio delle sezioni istologiche ha confermato le alterazioni osservate in vivo.

Bibliografia

Abdallaha M.A.E., Ibarraa C., Neelsb H., Harrada S., Covaci A. (2008). Comparative evaluation of liquid chromatography-mass spectrometry versus gas chromatography-mass spectrometry for the determination of hexabromocyclododecanes and their degradation products in indoor dust - Journal of Chromatography A, 1190:333-341.

Covaci A., Gerecke AC., Law RJ., Voorspoels S., Kohler M., Heeb Nv.; Leslie H., Allchin CR., De Boer J. (2006). Hexabromocyclododecanes (HBCDs) in the environment and humans: a review - Environmental Science and Technologies, 40, 12:3679-3688.

Covaci A., Voorspoels S., Ramosc L., Neels H., Blus R. (2007). Recent developments in the analysis of brominated flame retardants and brominated natural compounds - Journal of Chromatography A, 1153: 145-171.

EFSA (2011). Panel on Contaminant in the Food Chain - Scientific Opinion on Hexabromocyclododecanes (HBCDDs) in food. - EFSA Journal 2011.

Kalachova K., Pulkrabova J., Drabova L., Cajka T., Kocourek V., Hajslova J. (2011). Simplified and rapid determination of polychlorinated biphenyls, polybrominated diphenyl ethers, and polycyclic aromatic hydrocarbons in fish and shrimps integrated into a single method - Analytical Chimica Acta, 707:84-91.

Piersanti A, Tavoloni T, Bastari E, Lestingi C, Romanelli S, Saluti G, Moretti S, Galarini R . (2017). A GC-EI-MS/MS Method for the Determination of 15 Polybrominated Diphenyl Ethers (PBDEs) in Fish and Shellfish Tissues - Food Analytical Methods DOI 10.1007/s12161-017-1006-z.

Piersanti A., Tavoloni T., Bastari E., Lestingi C., Romanelli S, Saluti G., Moretti S., Galarini R. (2015). Polybrominated diphenyl ethers in mussels (Mytilus galloprovincialis) collected from Central Adriatic Sea - Marine Pollution Bulletin 101: 417-421.

OPEN REVIEW - Modulo per la "revisione aperta" di questo articolo, pubblicato sul numero 109/2018 di SPVet.it

Piersanti et al, 2018 - Sviluppo di un metodo per la determinazione di aminoglicosidi e colistine nel muscolo e nel latte (SPVet.it 109/2018)

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