Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 114, Giugno 2019 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
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Sorveglianza molecolare sui ceppi di Listeria monocytogenes isolati nell'Umbria e nelle Marche nel 2018
Molecular surveillance of Listeria monocytogenes strains isolated in Umbria and Marche Regions (Italy) in 2018

[Ver. 1.0]

Fabrizia Guidi1, Antonietta Gattuso2, Alfonsina Fiore2, Marta Naccari3, Letizia Radicci3, Stefano Lodolini4,Antonella Mencacci5,
Francesca Orecchioni6, Barbara Pieretti7, Antonella Pocognoli6, Antonella Repetto5, Enrico Di Raimo1, Anna Duranti1,
Stefano Fisichella1, Donatella Ottaviani1, Annalisa Petruzzelli1, Stefania Scuota1, Gianluca Striano1, Barbara Palombo1,
Francesco Pomilio8, Giuliana Blasi1.


(1) Istituto Zooprofilattico Sperimentale Umbria e Marche "Togo Rosati"
(2) Dipartimento di Sicurezza Alimentare, Nutrizione e Sanità Pubblica Veterinaria, Istituto Superiore di Sanità, Roma
(3) Presidio Ospedaliero Città di Castello, Città di Castello
(4) Azienda Sanitaria Unica Regionale Marche - Area Vasta 2, Senigallia
(5) Azienda Ospedaliera Santa Maria della Misericordia, Perugia
(6) Azienda Ospedaliera Universitaria Ospedali Riuniti, Ancona
(7) Azienda Ospedaliera Ospedali Riuniti Marche Nord, Pesaro
(8) Laboratorio Nazionale di Riferimento per L.monocytogenes, Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Abruzzo e del Molise "G.Caporale", Teramo


Abstract. Listeria monocytogenes (Lm) is a Gram-positive food-borne bacterium causing listeriosis in humans. Invasive listeriosis can occur in healthy people, but it affects predominantly immunocompromised individuals, elderly and young babies causing septicemia and meningitis. Moreover in pregnant women infections may lead to abortion, still birth, or fetal death. Although listeriosis is less frequent than other food-borne diseases, the fatality rate (13.8%) and hospitalization rates (98.6%) are high (EFSA 2018). Epidemiological surveillance programs rely on the continuous monitoring of circulating genotypes in space and time, enabling the rapid detection of common-source clusters and the implementation of control measures. For years, Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), has been considered the typing golden standard for epidemiological surveillance of Lm. Advances in high-throughput sequencing technologies have established Whole Genome Sequencing (WGS) based methods as powerful epidemiological typing tools with higher discriminatory power. Among these methods, the core genome MLST (cgMLST), MLST and SNP analyses were the most widely used for typing Lm in the public health sector. A joint ECDC-EFSA WGS database is being developed through the collaboration of Member States Competent Authorities for Lm. In Italy, the National Institute of Health (ISS) and the National Reference Laboratory for Lm (LNR-Lm) coordinate this activity. The Food Control Laboratory of IZSUM in Fermo, is responsible for the collection and the management of Lm strains isolated from human, food and environment in the regions of Umbria and Marche. This activity also includes the collection of epidemiological information about the isolates, the molecular typing of the strains and the elaboration of analytical results. The aim of this paper is to report the results coming from the activity carried out in the year 2018 by the IZSUM in collaboration with the LNR-Lm and the ISS

Riassunto. La listeriosi, è una zoonosi causata da Listeria monocytogenes (Lm) che si trasmette principalmente attraverso il consumo di alimenti contaminati. La forma gastro intestinale della malattia, si presenta più di frequente in soggetti immunocompetenti mentre la forma invasiva colpisce più di frequente soggetti appartenenti alle categorie a rischio, quali gli immunocompromessi, gli anziani e i bambini nei quali l'infezione provoca setticemia e meningite; anche le donne in gravidanza sono a rischio in quanto l'infezione può provocare aborto e natimortalità Rispetto ad altre zoonosi alimentari, la listeriosi, pur avendo una bassa prevalenza, presenta tassi di ospedalizzazione (98,6%) e di mortalità (13,8%) piuttosto elevati assumendo una particolare rilevanza sanitaria (EFSA 2018). La sorveglianza molecolare delle listeriosi, essenziale per identificare i veicoli alimentari, le fonti di contaminazione e la presenza di focolai, si è avvalsa per anni di metodi di tipizzazione quali la Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) e la Multilocus Sequence Typing (MLST). La prospettiva europea è tuttavia quella di adottare routinariamente, in sostituzione della PFGE, metodi di clusterizzazione basati sul Whole Genome Sequencing (WGS) quali la core genome MLST a fronte di un potere discriminante maggiore. In quest'ottica, le autorità competenti per Lm, in ottemperanza a quanto predisposto dall'ECDC, collaborano all'implementazione del joint ECDC-EFSA molecular typing database inserendo le sequenze WGS ottenute dagli isolati. In Italia questa attività viene svolta dall'Istituto Superiore di Sanità (ISS) per gli isolati clinici e dal Laboratorio Nazionale di Riferimento per Lm (LNR-Lm) per quelli ambientali e alimentare. La Sezione di Fermo dell'IZSUM è responsabile della raccolta e gestione dei ceppi, dei risultati analitici e dei metadati relativi alle Lm isolate da pazienti, alimenti ed ambiente nel territorio delle regioni Marche e Umbria. Scopo del presente lavoro è quello di descrivere ed analizzare dal punto di vista epidemiologico i dati ottenuti nel 2018 da questa attività, in collaborazione con il LNR e l'ISS



Introduzione
La listeriosi è una patologia soggetta a notifica obbligatoria (D.M. 15/12/1990) che si trasmette principalmente attraverso il consumo di alimenti contaminati. L'agente eziologico responsabile è Listeria monocytogenes (Lm), bacillo Gram positivo ubiquitario e in grado di moltiplicarsi e/o sopravvivere in condizioni difficili quali l'ambiente refrigerato. Queste caratteristiche lo rendono un importante problema nell'ambito della produzione alimentare soprattutto per alcune categorie di alimenti quali i Ready To Eat, i quali per via delle loro caratteristiche fisico-chimiche e delle modalità di conservazione, costituiscono un buon substrato per la moltiplicazione di Lm (Montero et al. 2015).
La listeriosi umana si manifesta in due forme cliniche, la forma gastro intestinale, che si presenta più di frequente in soggetti immunocompetenti e la forma invasiva, che colpisce più di frequente soggetti appartenenti alle categorie a rischio, quali gli immunocompromessi, gli anziani e i bambini nei quali l'infezione provoca setticemia e meningite; anche le donne in gravidanza sono a rischio in quanto l'infezione può provocare aborto e natimortalità (Di Pinto et al. 2010).

Rispetto ad altre zoonosi alimentari, la listeriosi, pur avendo una bassa prevalenza, presenta tassi di ospedalizzazione (98,6%) e di mortalità (13,8%) piuttosto elevati assumendo una particolare rilevanza sanitaria (EFSA 2018). Nella UE le infezioni da Lm sono oggetto di sorveglianza in sanità pubblica nell'ambito del programma Foodborne and Waterborne Diseases (FWD) dell'European Centre for Diseases Prevention and Control (ECDC) attraverso il sistema di sorveglianza europeo TESSy (The European Surveillance System) case-based (sorveglianza dei casi clinici di malattia) e TESSy isolate-based (sorveglianza molecolare sugli isolati di Lm) in conformità alla definizione di caso per la listeriosi (Decisione CE n. 945 del 22 Giugno 2018). La sorveglianza si focalizza sulle forme invasive. Inoltre, al fine di garantire la sicurezza degli alimenti destinati all'uomo il Regolamento CE No 2073/2005 e s.m.i., stabilisce i criteri microbiologici di sicurezza alimentare per Lm negli alimenti.
Dei 13 diversi sierotipi di Lm conosciuti, i sierotipi 1/2a, 1/2b e il 4b provocano circa il 95% dei casi di listeriosi (Chen et al. 2017); i sierotipi 1/2a, 1/2b e 1/2c, sono quelli più frequentemente isolati dagli alimenti, mentre il 4b è quello più spesso associato a focolai epidemici (Montero et al. 2015).
Secondo i dati più recenti, nel 2017 i casi confermati di listeriosi verificatisi nei paesi dell'Unione Europea (UE) sono stati in tutto 2480 con un tasso di notifica di 0,48 per 100.000 abitanti ed un trend statisticamente in aumento dal 2008 in ben 12 Stati Membri (SM). Nello specifico, l'Italia rientra tra i 5 SM che hanno riportato l'aumento più consistente nel quinquennio 2013-2017 (EFSA 2018).

Le attività di sorveglianza epidemiologica riguardanti le malattie a trasmissione alimentare non possono essere considerate complete ed esaustive se non viene effettuata la caratterizzazione molecolare o genomica degli isolati batterici e la successiva individuazione delle correlazioni epidemiologiche tra i ceppi isolati da casi clinici e alimenti contaminati. Nel caso di Lm, sono stati utilizzati la sierotipizzazione, la Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) e la Multi Locus Sequence Typing (MLST). Negli ultimi anni stiamo assistendo ad un utilizzo esponenziale del sequenziamento dell'intero genoma batterico (Whole genome sequencong -WGS) mediante la tecnologia della Next generation sequencing (NGS).
La possibilità di ottenere in tempi rapidi la sequenza di interi genomi, fornisce uno strumento di caratterizzazione altamente discriminante da impiegare negli studi epidemiologici (Pettengill et al. 2014). Sebbene vi sia ancora molto da fare in termini di standardizzazione delle piattaforme utilizzate, creazione di pipelines standard per l'analisi dei dati e di implementazione di database condivisi, la tendenza è quella di un progressivo superamento delle tecniche di tipizzazione tradizionali e molecolari (sierotipizzazione e PFGE) e la determinazione di Sequence Type, Clonal Complex e sierogruppo mediante i dati ottenuti in silico partendo dalle sequenze ottenute mediante NGS (ECDC, 2016).
L'utilizzo dei medesimi metodi di tipizzazione molecolare ha permesso, nel tempo, di costruire database dei risultati ottenuti da isolati clinici, alimentari ed ambientali a livello nazionale, comunitario e dei paesi terzi. La raccolta dei dati, coordinata da ECDC ed EFSA ha consentito, negli anni, di individuare focolai di listeriosi multi-stato, rintracciando e ritirando dal commercio lotti di prodotti potenzialmente contaminati al fine di tutelare la salute del consumatore.
Al fine di costruire database validi da un punto di vista epidemiologico è necessario che le autorità competenti operino in maniera corretta per raccogliere i dati e i risultati analitici ed alimentare i database di livello più elevato. La Sezione di Fermo dell'IZSUM ha la responsabilità della raccolta e gestione dei ceppi, dei risultati delle analisi e dei metadati relativi ai ceppi di L. monocytogenes isolati da pazienti e da tutti gli altri comparti nel territorio delle regioni Marche e Umbria.
Scopo del presente lavoro è riportare i risultati dell'attività di sorveglianza molecolare svolta nelle regioni Marche e Umbria nel corso del 2018, mediante la caratterizzazione dei ceppi di Lm umani, ambientali e alimentari.

Materiali e Metodi
L'attività di sorveglianza della listeriosi svolta dall'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche (IZSUM) nelle regioni di competenza, risulta dal consolidamento del flusso operativo implementato durante il focolaio di listeriosi verificatosi nelle Marche tra il 2015 e il 2016 e vede la collaborazione di tutte le Istituzioni pubbliche preposte al controllo delle Malattie Trasmesse da Alimenti (MTA). Nello specifico, il Laboratorio Controllo Alimenti (LCA) dell'IZSUM di Fermo, coordina la raccolta dei ceppi di Lm isolati presso i laboratori IZSUM, da alimenti e tamponi ambientali prelevati dai Servizi dei Dipartimenti di Prevenzione dell'Azienda Sanitaria Unica Regionale (ASUR).
Inoltre il LCA di Fermo coordina la raccolta dei ceppi clinici di Lm isolati dai laboratori delle Aziende Sanitarie Ospedaliere delle regioni Umbria e Marche e dagli altri Laboratori Ospedalieri. Tutti i ceppi pervenuti, vengono sottoposti a PCR per l'eventuale conferma di appartenenza alla specie, a Multiplex PCR (Doumith et al., 2004) per la determinazione del sierogruppo e sono inviati al Laboratorio Nazionale di Riferimento per Lm (LNR), presso l'IZS Abruzzo e Molise, per la determinazione del sierotipo e la caratterizzazione molecolare mediante PFGE e WGS (Guidi et al. 2018). Tutti gli isolati clinici, insieme alle schede per la raccolta dei dati epidemiologici, vengono inviati anche all'Istituto Superiore di Sanità (ISS) in quanto Operational Contact Point microbiologico per Lm nel network FWD-ECDC in Italia.
Il Laboratorio si occupa inoltre di inserire le informazioni relative ai ceppi nel SEAP, il Sistema Informativo per la Sorveglianza epidemiologica agenti patogeni di origine alimentare, gestito dal LNR per L. monocytogenes per conto del Ministero della Salute e di elaborare i risultati della sorveglianza.

Risultati e Discussione
Nel periodo compreso tra il 1 Gennaio e il 31 Dicembre 2018, nell'ambito dell'attività diagnostica dell'IZSUM relativa al Controllo Ufficiale, sono stati isolati, caratterizzati e conservati in collezione 266 ceppi di Lm. Sedici ceppi, inoltre, sono stati isolati da casi di listeriosi umani, 5 verificatisi nelle Marche e 11 in Umbria. La distribuzione dei ceppi per tipologia di matrice è riportata nella Tabella 1.

Tabella 1: Numero di ceppi isolati da ciascuna matrice
Table 1. Number of strains isolated from food, environment and humans


L'identificazione di specie mediante PCR è stata effettuata su 105 isolati e tutti hanno confermato l'appartenenza alla specie Lm. Il sierogruppo è stato determinato per tutti i 282 ceppi isolati; il 62% dei ceppi è risultato appartenente al sierogruppo IIa, il 24% al IIc, l'11% al IIb e il 3% al IVb. Dagli alimenti, il sierogruppo più diffuso tra i ceppi isolati è stato il IIa (115 ceppi), seguito dal IIc (48 ceppi), dal IIb (23 ceppi) e dal IVb (2 ceppi) (Figura 1).

Figura 1. Ceppi isolati da alimenti: distribuzione dei sierogruppi
Figura 1. Ceppi isolati da alimenti: distribuzione dei sierogruppi
Figure 1. Lm isolated from food: distribution of serogroups


Dai prodotti a base di carne sono stati isolati ceppi appartenenti a ciascuno dei quattro sierogruppi rilevati, risultando questa la categoria di alimenti con associata la popolazione più eterogenea fin da questo livello di caratterizzazione. La distribuzione percentuale di ciascun sierogruppo in questa categoria è riportata in Figura 2.

Figura 2. Ceppi isolati da prodotti a base di carne: distribuzione dei sierogruppi
Figura 2. Ceppi isolati da prodotti a base di carne: distribuzione dei sierogruppi
Figure 2. Lm isolated from meat products: distribution of serogroups


Tutti i ceppi isolati da prodotti della pesca sono risultati appartenenti al sierogruppo IIa mentre tutti quelli da formaggi al IIb. Per quanto riguarda i tamponi ambientali, il 68% dei ceppi di Lm isolati appartiene al sierogruppo IIa, il 23% al sierogruppo IIc e il 9% al sierogruppo IIb. Non sono stati isolati ceppi appartenenti al sierogruppo IVb (Figura 3).

Figura 3. Ceppi isolati da tamponi ambientali: distribuzione dei sierogruppi
Figura 3. Ceppi isolati da tamponi ambientali: distribuzione dei sierogruppi
Figure 3. Lm isolated from environment: distribution of serogroups


Dei 16 ceppi di Lm isolati, 7 ceppi sono risultati appartenenti al sierogruppo IIa (3 nelle Marche e 4 in Umbria), 7 al IVb (2 nelle Marche e 5 in Umbria), uno al IIb e l'altro al IIc.


Il 2018 ha rappresentato un anno di transizione, durante il quale il LNR, a fronte di un flusso analitico da anni consolidato basato sull'uso della PFGE per ottenere il massimo dettaglio epidemiologico, ha messo in atto la scelta di utilizzare per tutti i ceppi ricevuti il sequenziamento dell'intero genoma con pipelines sviluppate ad hoc per Lm decidendo di non eseguire più alcune metodiche, meno discriminanti ai fini della tipizzazione. Tra queste vi è la sierotipizzazione, la quale quindi non è stata effettuata per tutti i ceppi isolati nell'arco dell'anno. In particolare, dei 282 ceppi, solo 90 sono stati sottoposti alla determinazione del sierotipo mediante sieroagglutinazione, tutti riconducibili a quattro principali sierotipi: 1/2a (46,6%), 1/2b (22,2%), 1/2c (23,3%) e il 4b (7,8%).


I sierotipi circolanti sul territorio sono gli stessi individuati in precedenti studi condotti su isolati clinici, alimentari ed ambientali a livello nazionale (Gianfranceschi et al. 2009). La ripartizione per matrice è rappresentata in tabella 2. Considerando l'associazione tra sierotipi e tipologia di alimento, il sierotipo 1/2a è stato isolato più frequentemente nei prodotti a base di carne, il sierotipo 1/2b è stato riscontrato solo nei formaggi, mentre il sierotipo 1/2c è stato isolato esclusivamente in prodotti carnei mostrando, coerentemente con quanto riportato da Gianfranceschi et al. (2009) una spiccata associazione con questa tipologia di alimento. Nessuno dei 90 ceppi analizzati è risultato appartenere al sierotipo 4b.

Il sierotipo 1/2a è uno di quelli più comunemente associati a casi umani di listeriosi (Montero et al. 2015) e la sua diffusa circolazione nel territorio, negli alimenti e negli stabilimenti di produzione e trasformazione, rappresenta un potenziale rischio per la salute pubblica. Anche il sierotipo 4b è fra quelli più di frequente isolati da casi clinici (Lee et al. 2018) ed è particolarmente associato a focolai epidemici (Bergholtz et al. 2016). Nel territorio umbro marchigiano, negli ultimi tre anni si è verificato un aumento costante del numero dei casi di listeriosi umane dovuti al sierotipo 4b. Tre degli ultimi casi Umbri del 2018 di listeriosi umana con sierotipo 4b si sono verificati nell'arco di soli tre mesi, rispettivamente a settembre, a ottobre e a novembre e da essi sono stati isolati ceppi strettamente correlati.

Tabella 2. Distribuzione dei diversi sierotipi per matrice di isolamento
Table 2. Distribution of serotypes isolated from food, environment and humans


Per quanto riguarda la PFGE il 2018 è stato un anno di passaggio verso un utilizzo sempre più frequente del sequenziamento dei ceppi di Lm isolati. La PFGE è stata eseguita dal LNR e dall'ISS su tutti i ceppi clinici, mentre per quanto riguarda gli isolati alimentari ed ambientali il criterio seguito è stato quello di tipizzare esclusivamente un ceppo per ogni sierogruppo isolato dallo stesso campione, in totale 115 ceppi. Questo ha rappresentato un primo passo concreto verso la completa sostituzione della PFGE con metodi di clustering basati sull'analisi delle sequenze NGS (quali il core genome MLST). Nel complesso la PFGE dei 115 ceppi tipizzati ha evidenziato 32 profili con l'enzima ApaI, 25 con AscI e 34 profili combinati (Tabella 3).

Tabella 3: PFGE dei ceppi di Lm isolati: profili di restrizione combinati ApaI/AscI,matrice di isolamento e numero di ceppi
Tabella 3: PFGE dei ceppi di Lm isolati: profili di restrizione combinati ApaI/AscI,matrice di isolamento e numero di ceppi
Table 3. PFGE typing of Lm strains: combined ApaI/AscI profiles, sample type, number of strains for sample type and for combined profile


La popolazione batterica circolante sul territorio è risultata piuttosto eterogenea. Da un punto di vista epidemiologico, la presenza di 5 profili differenti di Lm nello stesso campione ribadisce la necessità di tipizzare più ceppi isolati dallo stesso campione esaminato. La presenza di Lm negli ambienti di produzione e manipolazione, riveste un ruolo rilevante nell'ambito della contaminazione degli alimenti, come emerge dal frequente isolamento del medesimo ceppo sia dalle superfici che dai prodotti di uno stesso stabilimento e/o esercizio commerciale. Per quanto riguarda i ceppi clinici, sono stati ottenuti 13 profili di macrorestrizione con l'enzima ApaI, 12 con AscI e 13 profili combinati (Tabella 4).

Tabella 4. PFGE dei ceppi di Lm isolati da casi di listeriosi: profili di restrizione combinati ApaI/AscI e numero di ceppi per provincia
Table 4. PFGE typing of Lm human strains: combined ApaI/AscI profiles and number of strains for province


L'unico caso di listeriosi verificatosi nella provincia di Macerata è risultato riconducibile al cluster d'infezione responsabile dell'epidemia che ha interessato le Marche tra il 2015 e il 2016. L'appartenenza al cluster epidemico, determinata in prima istanza dal profilo PFGE GX6A 12.0063/ GX6A 16.0183 (Tabella 4), è stata confermata mediante la Real-time PCR specifica, sviluppata dal LNR come metodo di screening rapido durante l'epidemia, e attraverso NGS. Il paziente affetto, di età infantile, è stato ricoverato e sottoposto a terapia antibiotica con risoluzione del caso. Nell'ambito dell'indagine epidemiologica, il Servizio di Igiene degli Alimenti di Origine Animale (SIAOA) competente per territorio ha eseguito controlli a casa del paziente, in tre supermercati presso i quali i familiari acquistavano abitualmente gli alimenti e presso sette loro fornitori diretti e indiretti.
In particolare nell'abitazione, sono stati eseguiti 24 tamponi ambientali da diversi locali, scegliendo superfici ed oggetti rappresentativi dei luoghi venuti a contatto con il paziente. Nel caso dei supermercati e degli stabilimenti fornitori, invece, sono state adottate le stesse procedure di campionamento del piano integrativo di controllo attuato nel febbraio 2016 durante l'emergenza listeriosi, effettuando 15 tamponi ambientali, 10 su superfici a contatto con gli alimenti e 5 su quelle non a contatto, scegliendo le aree in cui l'annidamento di Listeria era più probabile.

Dall'analisi dei campioni è stata riscontrata la contaminazione ambientale dovuta al cluster specifico di Lm, sia nell'abitazione che in uno degli esercizi commerciali (Tabella 3). Anche le superfici di un altro supermercato e di tre fornitori sono risultate contaminate da Lm ma il ceppo non era riconducibile al cluster epidemico. In tutti i luoghi sono state attuate le operazioni straordinarie di pulizia e sanificazione. Sebbene avviata tempestivamente e condotta in tempi brevi, l'indagine epidemiologica non ha consentito di stabilire la sorgente della contaminazione.
Il profilo GX6A12.0003/ GX6A16.0008 è stato riscontrato in due ceppi isolati da pazienti diversi. I due casi clinici si sono verificati l'uno nel mese di febbraio e l'altro nel mese di giugno rispettivamente nella province di Perugia e di Ancona. La possibilità che vi fosse una fonte di infezione comune non è stata supportata da approfondimenti epidemiologici.

Il profilo GX6A 12.0157/ GX6A 16.0043, invece, è stato rinvenuto in tre ceppi 4b isolati da pazienti diversi, tutti residenti nella provincia di Perugia. I tre casi, uno dei quali a carico di un neonato, si sono verificati nell'arco di soli tre mesi, rispettivamente a settembre, a ottobre e a novembre 2018. L'analisi delle sequenze mediante core-genome MLST ha evidenziato una stretta correlazione tra i tre ceppi, i quali differivano di pochi alleli. La possibilità che si tratti di un focolaio epidemico rafforzerebbe quanto detto precedentemente circa l'associazione tra sierotipo 4b ed epidemie di listeriosi, ma non può prescindere dall'individuazione di un nesso epidemico che supporti quanto emerso dalla tipizzazione molecolare. A tal fine sono in corso gli approfondimenti epidemiologici da parte dell'Autorità Competente.
I profili PFGE dei ceppi isolati dai casi clinici di listeriosi verificatisi nel 2018, sono stati poi inseriti nel database Bionumerics® del LNR al fine di individuare eventuali correlazioni con ceppi isolati da campioni alimentari e ambientali sul territorio nazionale a partire dal 2014. Otto dei tredici profili di restrizione ApaI /AscI inseriti nel database hanno dato un "match" completo con quelli di altri ceppi isolati da varie matrici (figure 4-11).

Molti di questi profili sono stati isolati a distanza di tempo da pazienti, prodotti ed ambienti geograficamente distanti, anche situati in regioni diverse. Questa, molto probabilmente è la diretta conseguenza della diffusa circolazione delle merci e della distribuzione dei prodotti alimentari anche in luoghi distanti tra loro.

Nello specifico, il profilo GX6A12.0003/ GX6A16.0008 (figura 4) è stato riscontrato in un totale di 25 ceppi presenti nel database. Dieci sono stati isolati da casi di listeriosi verificatisi tra il 2014 e il 2018 di cui: 3 nelle Marche (rispettivamente nel 2014, nel 2016 e nel 2018), 3 nel Lazio (nel 2016), 2 in Umbria (rispettivamente nel 2017 e nel 2018), uno in Piemonte (nel 2015) e uno in Abruzzo (nel 2017). Dei 14 ceppi di origine alimentare, due sono stati isolati da campioni di formaggio, uno dei quali analizzato in Umbria (nel 2014) e l'altro nelle Marche (nel 2015), mentre gli altri 12 ceppi sono stati isolati tutti nelle Marche (nel 2016) da prodotti carnei. L'unico ceppo ambientale infine è stato isolato nelle Marche (nel 2016).

Figura 4. Consultazione del database nazionale LNR_profilo PFGE combinato ApaI AscI GX6A12.0003GX6A16.0008
Figura 4. Consultazione del database nazionale LNR: profilo PFGE combinato ApaI /AscI GX6A12.0003/GX6A16.0008:
ceppo, anno e matrice di isolamento, luogo di prelievo del campione, sierotipo e sierogruppo.
I ceppi clinici oggetto della relazione sono evidenziati in rosso

Figure 4. Consultation of the Italian LNR PFGE profiles database: combined ApaI /AscI profile GX6A12.0003/GX6A16.0008:
matching strains, year and type of sample, location, serogroup and serotype. Clinical strains of this study are highlighted in red


Il pattern di restrizione GX6A12.0050/ GX6A16.0007 (figura 5) poi, è stato riscontrato in 39 ceppi del database nazionale. L'unico isolato di origine umana è relativo ad un caso di listeriosi che si è verificato in Umbria nel 2018. Trentatré ceppi sono stati isolati da alimenti a base di carne, di cui: 14 isolati nelle Marche (5 nel 2014, 3 nel 2015, 3 nel 2016 e 3 nel 2018), 12 in Abruzzo (3 nel 2015 e 9 nel 2016), 4 in Molise (3 nel 2015 e 1 nel 2016), 2 in Umbria (rispettivamente nel 2016 e nel 2017) e uno in Campania (nel 2017). Cinque ceppi infine sono stati isolati da superfici nelle Marche (3 nel 2016 e 2 nel 2018).

Consultazione del database nazionale LNR: profilo PFGE combinato ApaI /AscI GX6A12.0050/GX6A16.0007: ceppo, anno e matrice di isolamento, luogo di prelievo del campione, sierotipo e sierogruppo. Il ceppo clinico oggetto della relazione è evidenziato in rosso
Figura 5. Consultazione del database nazionale LNR: profilo PFGE combinato ApaI /AscI GX6A12.0050/GX6A16.0007:
ceppo, anno e matrice di isolamento, luogo di prelievo del campione, sierotipo e sierogruppo. Il ceppo clinico oggetto
della relazione è evidenziato in rosso

Figure 5. Consultation of the Italian LNR PFGE profiles database: combined ApaI /AscI profile GX6A12.0050/GX6A16.0007:
matching strains, year and type of sample, location, serogroup and serotype. Clinical strains of this study are highlighted in red


Il profilo GX6A12.0062/ GX6A16.0048 (figura 6) è risultato associato a 34 ceppi presenti nel database. Tre di essi sono relativi a casi di listeriosi, due verificatisi nel Lazio nel 2016 ed uno in Umbria nel 2018. Diciannove provengono da alimenti a base di carne di cui: 7 isolati nelle Marche (4 nel 2015 e 3 nel 2016), 6 nel Lazio (nel 2016), 4 in Trentino Alto Adige (nel 2015) e 3 in Friuli Venezia Giulia (nel 2016). Dodici ceppi infine sono stati isolati da tamponi ambientali di cui: 8 nelle Marche (nel 2016), 3 in Emilia Romagna (nel 2016), uno in Veneto (nel 2014).

Figura 6. Consultazione del database nazionale LNR: profilo PFGE combinato ApaI /AscI GX6A12.0062/GX6A16.0048: ceppo, anno e matrice di isolamento, luogo di prelievo del campione, sierotipo e sierogruppo. Il ceppo clinico oggetto della relazione è evidenziato in rosso
Figura 6. Consultazione del database nazionale LNR: profilo PFGE combinato ApaI /AscI GX6A12.0062/GX6A16.0048:
ceppo, anno e matrice di isolamento, luogo di prelievo del campione, sierotipo e sierogruppo. Il ceppo clinico oggetto
della relazione è evidenziato in rosso

Figure 6. Consultation of the Italian LNR PFGE profiles database: combined ApaI /AscI profile GX6A12.0062/GX6A16.0048:
matching strains, year and type of sample, location, serogroup and serotype. Clinical strains of this study are highlighted in red


Il profilo PFGE GX6A12.0063/ GX6A16.0183, relativo al caso di listeriosi verificatosi a Macerata nel 2018, è indistinguibile, come precedentemente riportato, con quello del cluster d'infezione responsabile dell'epidemia che ha interessato le Marche tra il 2015 e il 2016. Dalla consultazione del database del LNR, sono risultati 145 ceppi con questo profilo.
Ventotto sono isolati clinici, di cui uno relativo al caso del 2018 e i restanti a quelli verificatisi durante il focolaio. Tutti i 51 ceppi isolati da alimenti invece, sono relativi ai controlli fatti nel biennio 2015-2016 per rintracciare la fonte dell'epidemia. Infine dei 65 ceppi di origine ambientale, 35 sono stati isolati nell'ambito dei suddetti controlli e del successivo piano di campionamento integrativo, mentre 30 sono relativi all'indagine epidemiologica eseguita per il caso del 2018 (tabella 3).

Il profilo GX6A12.0073/GX6A16.0010 (figura 7), è stato riscontrato in 49 ceppi presenti nel database. Due di questi sono clinici e relativi a casi di listeriosi verificatisi nelle Marche (rispettivamente nel 2014 e 2018). Trentatré ceppi sono di origine alimentare e di questi, 28 derivano dai prodotti lattiero-caseari di uno stesso caseificio situato nelle Marche (isolati tra il 2014 e il 2016) e quattro da prodotti a base di carne, di cui uno isolato in Piemonte (nel 2015) e tre nelle Marche (due nel 2016 e uno nel 2018).
Quattordici ceppi infine sono di origine ambientale e sono stati isolati nelle Marche (2 nel 2014, 3 nel 2015 e 9 nel 2016); dieci di essi provengono dalle superfici del suddetto caseificio marchigiano.

Figura 7. Consultazione del database nazionale LNR: profilo PFGE combinato ApaI /AscI GX6A12.0073/GX6A16.0010: ceppo, anno e matrice di isolamento, sierotipo e sierogruppo. Il ceppo clinico oggetto della relazione è evidenziato in rosso
Figura 7. Consultazione del database nazionale LNR: profilo PFGE combinato ApaI /AscI GX6A12.0073/GX6A16.0010:
ceppo, anno e matrice di isolamento, sierotipo e sierogruppo. Il ceppo clinico oggetto della relazione è evidenziato in rosso

Figure 7. Consultation of the Italian LNR PFGE profiles database: combined ApaI /AscI profile GX6A12.0073/GX6A16.0010:
matching strains, year and type of sample, location, serogroup and serotype. Clinical strains of this study are highlighted in red


Come si evince dalla figura 8, il dendrogramma relativo al pattern di restrizione GX6A12.0143 /GX6A16.0048 comprende in tutto 13 ceppi. Solo uno è di origine umana ed è stato isolato da un caso di listeriosi che si è verificato in Umbria nel 2018. Nove ceppi provengono da alimenti, in particolare da prodotti a base di carne, e di questi 5 sono stati isolati nelle Marche (4 nel 2015 e 1 nel 2016), 3 in Abruzzo (nel 2015) e uno in Molise (nel 2017). I tre ceppi ambientali infine sono tutti provenienti dalle Marche (2 isolati nel 2015 e uno nel 2018).

Figura 8. Consultazione del database nazionale LNR: profilo PFGE combinato ApaI /AscI GX6A12.0143/GX6A16.0048: ceppo, anno e matrice di isolamento, luogo di prelievo del campione, sierotipo e sierogruppo. Il ceppo clinico oggetto della relazione è evidenziato in rosso
Figura 8. Consultazione del database nazionale LNR: profilo PFGE combinato ApaI /AscI GX6A12.0143/GX6A16.0048:
ceppo, anno e matrice di isolamento, luogo di prelievo del campione, sierotipo e sierogruppo. Il ceppo clinico oggetto
della relazione è evidenziato in rosso

Figure 8. Consultation of the Italian LNR PFGE profiles database: combined ApaI /AscI profile GX6A12.0143/GX6A16.0048:
matching strains, year and type of sample, location, serogroup and serotype. Clinical strains of this study are highlighted in red


Il profilo GX6A12.0149/ GX6A16.0132 (figura 9) è stato riscontrato in 12 ceppi. Cinque di questi sono relativi a casi di listeriosi di cui uno verificatosi in Abruzzo nel 2014, due nelle Marche, rispettivamente nel 2014 e nel 2018, uno in Piemonte nel 2015 ed uno in Umbria nel 2018. I ceppi restanti, tutti di origine alimentare, sono stati isolati da formaggi prodotti nella Regione Marche (nel 2016).

Figura 9. Consultazione del database nazionale LNR: profilo PFGE combinato ApaI /AscI GX6A12.0149/GX6A16.0132: ceppo, anno e matrice di isolamento, luogo di prelievo del campione, sierotipo e sierogruppo. Il ceppo clinico oggetto della relazione è evidenziato in rosso
Figura 9. Consultazione del database nazionale LNR: profilo PFGE combinato ApaI /AscI GX6A12.0149/GX6A16.0132:
ceppo, anno e matrice di isolamento, luogo di prelievo del campione, sierotipo e sierogruppo. Il ceppo clinico oggetto
della relazione è evidenziato in rosso

Figure 9. Consultation of the Italian LNR PFGE profiles database: combined ApaI /AscI profile GX6A12.0149/GX6A16.0132:
matching strains, year and type of sample, location, serogroup and serotype. Clinical strains of this study are highlighted in red


Il profilo GX6A12.0157/ GX6A16.0043 (figura 10) è rappresentato da soli quattro ceppi del database nazionale, tutti relativi a casi di listeriosi verificatisi nel 2018, di cui tre in Umbria ed uno in Abruzzo.

Figura 10. Consultazione del database nazionale LNR: profilo PFGE combinato ApaI /AscI GX6A12.0157/GX6A16.0043: ceppo, anno e matrice di isolamento, luogo di prelievo del campione, sierotipo e sierogruppo. I ceppi clinici oggetto della relazione sono evidenziati in rosso
Figura 10. Consultazione del database nazionale LNR: profilo PFGE combinato ApaI /AscI GX6A12.0157/GX6A16.0043:
ceppo, anno e matrice di isolamento, luogo di prelievo del campione, sierotipo e sierogruppo. I ceppi clinici oggetto
della relazione sono evidenziati in rosso

Figure 10. Consultation of the Italian LNR PFGE profiles database: combined ApaI /AscI profile GX6A12.0157/GX6A16.0043: matching strains, year and type of sample, location, serogroup and serotype. Clinical strains of this study are highlighted in red


L'ultimo profilo, GX6A12.0298/GX6A16.0227 (figura 11) è presente in soli due ceppi del database, entrambi clinici di cui uno isolato nel Lazio e uno nelle Marche rispettivamente nel 2016 e nel 2018.

Figura 11. Consultazione del database nazionale LNR: profilo PFGE combinato ApaI /AscI GX6A12.0298/GX6A16.0227: ceppo, anno e matrice di isolamento, luogo di prelievo del campione, sierotipo e sierogruppo. Il ceppo clinico oggetto della relazione è evidenziato in rosso
Figura 11. Consultazione del database nazionale LNR: profilo PFGE combinato ApaI /AscI GX6A12.0298/GX6A16.0227:
ceppo, anno e matrice di isolamento, luogo di prelievo del campione, sierotipo e sierogruppo. Il ceppo clinico oggetto
della relazione è evidenziato in rosso

Figure 11. Consultation of the Italian LNR PFGE profiles database: combined ApaI /AscI profile GX6A12.0298/GX6A16.0227:
matching strains, year and type of sample, location, serogroup and serotype. Clinical strains of this study are highlighted in red


I dati epidemiologici insieme con i ceppi isolati dai casi clinici di listeriosi sono stati regolarmente inviati all'ISS Operational Contact Point (OCP) dell'ECDC per la listeriosi. Con cadenza annuale l'ISS-OCP invia al sistema europeo TESSy informazioni epidemiologiche e microbiologiche dei ceppi di Lm isolati, mentre i profili PFGE sono stati routinariamente inseriti nel database ECDC attraverso l'applicativo web: https://tessy.ecdc.europa.eu. In accordo con le prospettive della sorveglianza europea verso l'adozione routinaria della caratterizzazione degli isolati mediante WGS in sostituzione della PFGE, anche l'ISS-OCP per tutto il 2018 ha sottoposto a caratterizzazione molecolare mediante PFGE e WGS gli isolati clinici. I profili PFGE e le sequenze genomiche sono stati inviati al database ECDC.
A partire dal 2019, in ottemperanza a quanto predisposto dall'ECDC per Lm, tutti i ceppi clinici isolati verranno sottoposti a WGS e le sequenze inserite nel nuovo database ECDC. Un importante obbiettivo raggiunto nell'ambito dell'attività di sorveglianza è stato il Decreto del Dirigente ARS n. 51 del 2 agosto 2018, con il quale sono state approvate, per la Regione Marche, le Linee Guida di intervento in caso di focolaio di Listeria monocytogenes (LLGG), al fine di definire e standardizzare le modalità di gestione dei focolai di listeriosi e dei casi sporadici. Il decreto, che fornisce la definizione di caso di listeriosi secondo i criteri dell'ECDC e include anche un questionario epidemiologico standardizzato specifico, definisce inoltre il flusso degli isolati di Lm e delle relative informazioni diagnostiche.

La validazione delle LLGG è stata realizzata organizzando un evento formativo dal titolo "Emergenze in sicurezza alimentare: simulazione di indagine in caso di malattia a trasmissione alimentare". Il corso si è svolto il 22 novembre 2018 presso la Sezione di Fermo dell'IZSUM, ha previsto la simulazione di un'indagine per la gestione di una o più notifiche di Listeriosi da parte di un Team di Indagine, convocato a livello di Area Vasta e di un Team regionale. I partecipanti hanno svolto l'indagine attenendosi alle diverse fasi riportate nella linea guida.

Conclusioni
Il sistema di gestione dei ceppi di Lm attuato nella regione Marche e valido anche per la regione Umbria, rappresenta il consolidamento del flusso operativo implementato durante il focolaio di listeriosi verificatosi nelle Marche tra il 2015 e il 2016 e vede la collaborazione di tutte le Istituzioni pubbliche preposte al controllo delle Malattie Trasmesse da Alimenti (MTA). Il Decreto ARS n. 51/18 recante le LLGG di intervento in caso di focolaio di listeriosi formalizza, nella regione Marche, il sistema di intervento nell'ambito delle forme di infezione da Listeria.
Il coordinamento di tutte le attività e delle diverse competenze nell'ambito della sorveglianza epidemiologica e molecolare, ha consentito di gestire un elevato numero di ceppi batterici con tempistiche ottimali ed una buona suddivisione del lavoro.
La ricomparsa del cluster d'infezione responsabile dell'epidemia di listeriosi che ha interessato le Marche, isolato da un caso clinico verificatosi a Macerata, ribadisce la necessità di mantenere elevato il livello di sorveglianza. La tempestività con cui è stata condotta l'indagine epidemiologica e gli accertamenti diagnostici che hanno portato a riconoscere il cluster epidemico (PFGE GX6A 12.0063/GX6A 16.0183), dimostrano l'efficacia del flusso operativo implementato nonché dell'importanza di una valutazione sistematica e tempestiva dei risultati ottenuti e della loro condivisione con tutti gli operatori coinvolti nella tutela della salute pubblica.

La collaborazione con l'LNR ed il supporto da esso fornito nell'ambito della tipizzazione degli isolati, hanno permesso di acquisire nuovi protocolli diagnostici nonché di approfondire le conoscenze riguardo tecnologie all'avanguardia quali l'NGS con un primo approccio all'interpretazione dei risultati ottenuti. Le attività di sorveglianza molecolare della Listeriosi, basate sulla tipizzazione degli isolati da alimenti, tamponi e casi clinici, sono ormai punto cardine per l'individuazione e lo studio dei focolai e per le indagini epidemiologiche relative ai casi sporadici.
Questo approccio si rivela vincente anche per studiare la popolazione microbica associata ad un determinato territorio. Nel contesto della sorveglianza epidemiologica, infatti, i metodi di tipizzazione molecolare possono essere usati per monitorare la diffusione geografica e i cambiamenti prevalenti di cloni epidemici o endemici con l'obiettivo di una valutazione a lungo termine di strategie preventive o per il controllo di infezioni emergenti e riemergenti. Sebbene vi sia ancora molto da fare in termini di uniformazione delle piattaforme utilizzate, creazione di pipelines standard per l'analisi dei dati ed implementazione di database condivisi, la tendenza globale è quella di un progressivo superamento delle tecniche di tipizzazione tradizionali finora utilizzate (PFGE, MLST, ecc..), per le quali attualmente già molti laboratori ricavano i risultati in silico partendo dalle sequenze ottenute mediante NGS (ECDC, 2016). Anche il LNR e l'ISS-OCP si stanno adeguando e a partire dagli isolati di Lm relativi al 2019, non effettueranno più la tipizzazione mediante PFGE, a fronte del flusso analitico, ormai avviato, basato sul WGS con pipelines sviluppate ad hoc per questo patogeno.
La necessità di allinearsi a questa tendenza, sviluppando competenze soprattutto nell'ambito dell'analisi bioinformatica delle sequenze, diventa pertanto sempre più urgente al fine di non rimanere esclusi dalle attività di sorveglianza e di studio epidemiologico della Listeriosi e di altre zoonosi.


Ringraziamenti
Si ringrazia tutto il personale dei Dipartimenti di Prevenzione dell'ASUR per le attività di campionamento e di acquisizione delle informazioni in campo e tutto il personale tecnico dei laboratori che ha supportato l'isolamento, la collezione e la caratterizzazione dei ceppi di L. monocytogenes nell'anno oggetto del lavoro.


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Decisione n. 1082/2013/UE del Parlamento Europeo e del Consiglio del 22 ottobre 2013 relativa alle gravi minacce per la salute a carattere transfrontaliero e che abroga la decisione n. 2119/98/CE.

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OPEN REVIEW - Modulo per la "revisione aperta" di questo articolo, pubblicato sul numero 114/2019 di SPVet.it


Guidi et al., 2019 - Sorveglianza molecolare sui ceppi di Listeria monocytogenes isolati nell'Umbria e nelle Marche nel 2018 (SPVet.it 114/2019)
Guidi et al., 2019 - Sorveglianza molecolare sui ceppi di Listeria monocytogenes isolati nell'Umbria e nelle Marche nel 2018 (SPVet.it 114/2019)

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Sorveglianza molecolare sui ceppi di Listeria monocytogenes isolati nell'Umbria e nelle Marche nel 2018 (SPVet.it 114/2019) by Guidi et al., 2019 is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
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