Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 99, Dicembre 2016 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
1 Istituto Zooprofilatico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
2 Università Politecnica delle Marche
Abstract. Over the last two decades the Adriatic Sea has frequently experienced blooms of harmful algal species producing marine toxins and contaminations of bivalve molluscs.
Since March 2012 the Istituto Zooprofilattico Sperimentale of Umbria and Marche (IZSUM - Italy) implemented the official LC-MS/MS protocol for the determination of marine lipophilic toxins in bivalve molluscs. This approach allowed to detect Azaspiracids (AZAs) traces in mussels farmed along the Marche Region coast. AZAs are lipophilic marine toxins causing Azaspiracid Poisoning (AZP), with gastrointestinal symptoms in consumers, similar to the diarroethic poisoning, but with a different toxicity mechanism. Approximately 30 analogues were identified until now, but only AZA1, AZA2 and AZA3 are regulated for their occurrence and toxicity. The name describes the toxin chemical features: a six-membered cyclic amine moiety (AZA), a unique tri-spiro assembly (SPIRO), and a carboxylic acid group (ACID). From their discovery (bay of Killary, Ireland 1995), AZAs turned out to be widely distributed in different geographical areas and some dinoflagellate belonging to Azadinium genus (A. spinosum, A. Poporum, A dexteroporum) and Amphidoma (A. languida) were identified as AZA-producers. Until now the AZA-producer microalgae was never identified in the Adriatic Sea, while A. dexteroporum was isolated in the Tyrrhenian Sea (Gulf of Naples) as responsible of AZA-like compounds biosynthesis.
The aims of this research were to evaluate the presence of AZAs in mussels bred along the Marche coast and to search their primary producer in the sea. Successively a study of the accumulation and metabolization of AZAs by mussels exposed to a AZA-producing microalgae it has been carried out. In the contaminated organisms a series of biological responses (biomarkers) to AZA contamination were tested.
Riassunto.Da oltre due decadi nel mar Adriatico si ripresentano con regolarità fioriture di fitoplancton potenzialmente tossico e contaminazioni di molluschi bivalvi da parte di tossine da esso prodotte. Dal marzo 2012, l'Istituto Zooprofilattico Sperimentale Umbria e Marche (IZSUM) ha implementato il metodo ufficiale in cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS/MS) per la determinazione delle biotossine algali lipofiliche nei molluschi (AESAN 2015). Tale approccio ha permesso di evidenziare la presenza in tracce di azaspiracidi (AZAs) in mitili allevati lungo il litorale marchigiano. Gli AZAs sono biotossine lipofiliche che causano sintomi gastrointestinali simili a quelli dell'acido okadaico ma mediante un diverso meccanismo di azione tossica, ancora poco chiaro. Tale gruppo di biotossine marine annovera più di 30 analoghi strutturali ma solo 3 (AZA-1, AZA-2, AZA-3) sono attualmente regolamentati. Gli AZAs sono polieteri che contengono un'ammina ciclica (gruppo AZA), gruppi spiro e un acido carbossilico terminale. Dalla loro scoperta (baia di Killary, Irlanda, 1995) gli AZAs hanno raggiunto una distribuzione pressoché globale e la loro origine biogenica è stata identificata nelle microalghe appartenenti ad alcune specie dei generi Azadinium (A. spinosum, A. poporum, A. dexteroporum) ed Amphidoma (A. languida). Nell'ambito di questa ricerca si è proceduto in primo luogo alla valutazione della presenza di AZAs nei mitili allevati lungo la costa marchigiana e alla ricerca del loro produttore primario. In una seconda fase è stato effettuato uno studio della capacità di accumulo e metabolizzazione degli AZAs da parte di mitili esposti in acquario ad una microalga produttrice di tali composti. Negli organismi contaminati è stata poi verificata una serie di risposte biologiche (biomarkers) nei confronti delle tossine.
Video storytelling:
Roberta Orletti e Simone Bacchiocchi presentano il progetto sulla "Presenza di azaspiracidi nei mitili dell'Adriatico" (2016)
(SPVet.it 99/2016)
Definizione della ricerca svolta
Nel corso della ricerca é stato effettuato un monitoraggio di due anni di mitili e fitoplancton provenienti dalla costa marchigiana. I mitili sono stati analizzati mediante LC-MS/MS per la determinazione di AZA-1,-2 e -3 allo scopo di evidenziare i trend stagionali e i livelli massimi raggiunti per la contaminazione da parte di tali tossine. Contestualmente le cellule di microalghe sospette di appartenere al genere Azadinium riscontrate nei campioni di fitoplancton sono state isolate ed identificate mediante osservazione al microscopio.
Un ceppo recentemente isolato di A. dexteroporum produttore di AZAs (Golfo di Napoli) è stato mantenuto in coltura per i successivi esperimenti di esposizione di mitili. Sono stati realizzati due esperimenti di esposizione di mitili (Mytilus galloprovincialis) ad A. dexteroporum. Questi hanno permesso di valutare l'accumulo, la metabolizzazione e la detossificazione degli AZAs ed una serie di risposte biologiche (biomarkers) nei mitili esposti.
I principali biomarkers sono stati indagati nei mitili esposti secondo protocolli già validati e ampiamente utilizzati in studi di ecotossicologia (Gorbi et al., 2012; Gorbi et al., 2013).
Descrizione degli obiettivi della ricerca
Gli obiettivi della presente ricerca sono riportati di seguito:
Valutazione della contaminazione da AZAs nei mitili della costa marchigiana;
Individuazione e caratterizzazione tossicologica del produttore biologico nel mar Adriatico;
Studio dei processi di accumulo, metabolizzazione e detossificazione degli AZAs in mitili esposti all'alga in condizioni di laboratorio;
Studio delle risposte biologiche (biomarkers) negli organismi esposti.
Si è valutato quindi sia l'entità del rischio sanitario legato alla contaminazione dei mitili marchigiani da parte degli AZAs e alla presenza in mare del un produttore primario di tali composti tossici, sia l'impatto che essi hanno sulla salute, e quindi salubrità come alimento, dei mitili. Nel complesso i risultati di questo progetto costituiscono, a nostro avviso, un valido strumento a disposizione dei laboratori ufficiali per il monitoraggio del fitoplancton tossico, e per una corretta valutazione del rischio legato al consumo di prodotti ittici contaminati da AZAs.
Sintesi di Materiali e Metodi
Piano sperimentale
Il monitoraggio degli AZAs nei mitili marchigiani ha riguardato allevamenti fra quelli presenti lungo la costa marchigiana. Il campionamento è stato effettuato mensilmente durante il periodo compreso tra Settembre 2014 e Novembre 2015, ed i campioni analizzati mediante il metodo ufficiale in LC-MS/MS per la determinazione delle biotossine marine lipofiliche (AESAN 2015).
I campionamenti del fitoplancton sono stati effettuati mensilmente, sempre a partire da Settembre 2014, da due stazioni di prelievo una a nord ed una nella parte centrale della costa. Una sonda multiparametrica è stata utilizzata per la visualizzazione del profilo dei parametri fisico chimici della colonna d'acqua.
A seguito delle difficoltà riscontrate nell'individuazione del produttore primario di AZAs in Adriatico, per i successivi esperimenti di esposizione dei mitili in acquario finalizzati allo studio dei processi di accumulo e detossificazione, del metabolismo e dei potenziali meccanismi di azione biochimica degli AZAs si è deciso di utilizzare un ceppo di A. dexteroporum proveniente dal Golfo di Napoli.
Figura 1. Colorazione Neutral Red nei lisosomi
[immagine Stefania Gorbi (Università Politecnica delle Marche)]
Analisi fitoplancton
Dalle dinoflagellate tecate che presentavano al microscopio ottico il morfotipo tipico di Azadinium sono state allestite colture monoclonali per i successivi esperimenti di microscopia elettronica a scansione e di esposizione in acquario. Contemporaneamente, un ceppo di Azadinium dexteroporum proveniente dal golfo di Napoli (già noto per la produzione di diversi analoghi di tossine del gruppo degli AZAs) è stato mantenuto in coltura ed utilizzato per la messa a punto del metodo di estrazione degli AZAs dalle microalghe e lo studio del profilo tossico.
Successivamente ulteriori colture di A. dexteroporum sono state predisposte per allestire gli esperimenti di esposizione dei mitili in condizioni di laboratorio.
Esposizione dei mitili ad A. dexteropoum
Mitili (Mytilus galloprovincialis) ottenuti da una acquacoltura locale (Ancona) sono stati ripuliti con uno spazzolino per rimuovere ogni cellula algale dalla conchiglia e sono stati mantenuti in stabulazione in un sistema di vasche a ricircolo chiuso, in acqua di mare filtrata.
Sono stati effettuati due esperimenti di esposizione. Lo scopo del primo esperimento è stato quello di verificare eventuali effetti letali od alterazioni macroscopiche indotti dall'esposizione all'alga A. dexteroporum e di valutare la capacità di bioaccumulo delle tossine AZAs nei mitili esposti. A questo scopo gli individui sono stati distribuiti in bakers contenenti acqua di mare sintetica, cibati con una microalga non tossica, ed acclimatati alle condizioni di laboratorio.
Durante l'esperimento i mitili sono stati esposti a diverse concentrazioni di A. dexteroporum, prelevati a diversi intervalli di tempo e sottoposti ad analisi LC-MS/MS per valutare il bioaccumulo di AZAs.
Il secondo esperimento è stato pianificato allo scopo di analizzare le risposte biologiche (biomarkers) nei mitili esposti, il loro profilo tossico e la velocità di bioaccumulo mediante LC-MS/MS; è stato utilizzato un maggior numero di organismi distribuiti casualmente in vasche di maggior volume ed acclimatati come sopra descritto.
Nelle vasche di controllo gli organismi venivano cibati solo con l'alga non tossica mentre gli organismi esposti ricevevano sia l'alga non tossica, sia A. dexteroporum alla concentrazione più elevata già testata nel precedente esperimento. Alcuni organismi esposti sono stati poi mantenuti nelle stesse condizioni ulteriori giorni, ma senza la somministrazione dell'alga tossica, allo scopo di valutare la capacità di depurazione dalle biotossine e le variazioni dei parametri biologici, una volta terminata l'esposizione all'alga tossica.
Dopo diversi intervalli di tempo sia gli organismi di controllo che quelli esposti sono stati campionati per l'analisi chimica sia sul corpo intero che sulla sola ghiandola digestiva con l'intento di studiare la ripartizione degli AZAs fra i diversi tessuti. Allo scopo di comprendere meglio il meccanismo di accumulo dei diversi analoghi, sono state analizzate anche le pseudofeci raccolte sul fondo delle vasche prima di ogni cambio di acqua. Tutte le matrici sono state omogeneizzate e congelate a -20°C fino al momento dell'analisi.
Per le analisi delle risposte immunitarie, enzimatiche e della capacità antiossidante totale, dei pool di emolinfa e di ghiandola digestiva sono stati ottenuti dagli organismi sia di controllo che esposti. L'emolinfa è stata prelevata dal muscolo adduttore, in parte direttamente congelata in azoto liquido e mantenuta a -80°C per l'analisi di alcune attività enzimatiche ed in parte immediatamente processata per le analisi di altri biomarker. Le ghiandole digestive sono state dissezionate e congelate a -80°C fino al momento delle analisi.
Figura 2. Colorazione Rosso neutro in citosole in lisosomi
[immagine Stefania Gorbi (Università Politecnica delle Marche)]
Estrazione degli AZAs
Dai pellet algali di A. dexteroporum, dai tessuti dei mitili di campo e da quelli esposti e dalle pseudofeci sono stati estratti gli AZAs mediante procedure descritte in letteratura o nel metodo ufficiale per la determinazione delle biotossine lipofiliche.
Analisi in LC-MS/MS
Per le analisi LC-MS/MS è stato utilizzato un cromatografo liquido a pompa quaternaria interfacciato con uno spettrometro di massa. La cromatografia è stata effettuata in condizioni basiche (pH=10.5). Lo spettrometro di massa é dotato di una sorgente ESI (Electrospray ionization) e di un sistema ibrido triplo quadrupolo/ trappola ionica. I parametri di spettrometria di massa sono stati ottimizzati mediante esperimenti di infusione dello standard commerciale AZA1 fornito dal NRC Certified Reference Materials Program (Institute for MarineBiosciences, Halifax, NS, Canada).
Per la determinazione in LC-MS/MS degli AZAs nei mitili della costa marchigiana sono stati realizzati esperimenti di tipo MRM (Multiple Reaction Monitoring) monitorando due transizioni per tossina, delle quali quella a più alta intensità è stata utilizzata per la quantifica e l'altra a scopo di identificazione. Nella prima fase di monitoraggio sono stati ricercati esclusivamente gli analoghi AZA-1, AZA-2 ed AZA-3, come previsto dal Regolamento (CE) N. 2074/2005. La quantifica di ogni tossina è stata effettuata utilizzando rette di calibrazione costruite con il metodo dello standard esterno e l'area media della due letture strumentali acquisite. Assumendo una risposta equimolare, l'AZA1 è stato utilizzato per la quantifica indiretta dell'AZA2 e dell'AZA3.
I campioni che evidenziavano una contaminazione da AZAs, sono stati sottoposti ad ulteriori esperimenti. In particolare é stata effettuata la ricerca di eventuali analoghi ottenuti da processi di biotrasformazione ad opera del mollusco a partire da AZA1 ed AZA2. E' noto infatti come questi due analoghi prodotti dalle microalghe subiscano, una volta all'interno dei molluschi, dei processi di metabolizzazione (per esempio idrossilazione o decarbossilazione) dando origine ad analoghi strutturalmente diversi (Jauffrais et al., 2012). Gli spettri sono stati acquisiti in modalita' MRM selezionando tre transizioni caratteristiche per analogo.
Negli estratti delle microalghe e dei mitili esposti è stato effettuato preliminarmente uno screening degli AZAs presenti, mediante esperimenti di tipo Precursor Ion Scan focalizzati su frammenti caratteristici di tali molecole. Gli ioni precursori risultanti sono stati sottoposti a conferma mediante esperimenti di tipo CID (Collision Induced Dissociation) e confronto dei pattern di frammentazione con quello ottenuto per lo standard commerciale (CRM-AZA1).
I composti identificati come analoghi degli AZAs sono stati quantificati nell'estratto algale mediante esperimenti di tipo MRM. Assumendo una risposta equimolare, l'AZA1 è stato utilizzato per la quantifica indiretta di tutti gli analoghi AZAs.
Analisi dei biomarkers
I principali biomarkers sono stati indagati nei mitili esposti secondo protocolli già validati e ampiamente utilizzati in studi di ecotossicologia (Gorbi et al., 2012; Rossi et al., 2016). Questi includono parametri di risposta immunitaria, marker di proliferazione perossisomiale e di neurotossicità, parametri di disturbo ossidativo e marker di danno genotossico, studiati attraverso tecniche spettrofotometriche, spettrofluorimetriche, gascromatografiche, di microscopia ottica e a fluorescenza. Le risposte immunitarie sono state analizzate negli emociti dei mitili, attraverso l'analisi della stabilità delle membrane lisosomiali, del rapporto granulociti/ialinociti e della attività di fagocitosi. La proliferazione perossisomiale è stata valutata attraverso l'analisi dell'attività enzimatica della acil-CoA ossidasi (ACOX). Lo studio delle risposte antiossidanti è stato affrontato sia attraverso l'analisi del singolo sistema antiossidante (catalasi, glutatione S-transferasi, glutatione reduttasi, glutatione perossidasi) che con la misura della capacità antiossidante totale stimata tramite il saggio TOSC-A (Total Oxyradical Scavenging Capacity Assay).
Il danno genotossico è stato valutato nell'emolinfa dei mitili attraverso il test della cometa.
Descrizione delle prospettive future derivanti dallo studio
Le attività svolte nell'ambito della presente ricerca hanno permesso di effettuare una valutazione della contaminazione da parte degli azaspiracidi dei mitili allevati lungo la costa marchigiana. Dallo studio del trend temporale di questo fenomeno è stato possibile individuare il periodo stagionale più critico dato questo che potrà essere utile in futuro ai laboratori istituzionali che si occupano di monitoraggio delle biotossine marine e del fitoplancton tossico per modulare i propri livelli di attenzione verso questa problematica durante l'anno.
Sebbene non si sia riusciti nell'intento di identificare il produttore biologico primario di AZAs presente nelle acque marchigiane, è auspicabile che si continui il lavoro necessario per raggiungere questo obiettivo in un futuro prossimo anche al fine di una inclusione di tale organismo nell'elenco del fitoplancton tossico periodicamente monitorato dall'Agenzia Regionale per la Protezione Ambientale delle Marche (ARPAM). Il protocollo sperimentale messo a punto per la caratterizzazione del profilo tossico di A. dexteroporum potrà essere utilizzato anche con questa microalga fornendo un importante contributo per la gestione del rischio da essa rappresentato. I dati ottenuti circa le differenti risposte biologiche indotte dagli AZAs nei mitili esposti all'alga produttrice sottolineano infine la necessità di approfondire gli effetti dannosi di queste tossine anche a carico della salute e della salubrità come alimenti di questi organismi marini.
Bibliografia
AESAN 2015. AgenciaEspañola de Securidad Alimentaria y Nutrición. EU-Harmonised Standard Operating Procedure for determination of Lipophilic marine biotoxins in molluscs by LC-MS/MS vers. 5, (2015).
Bacchiocchi S., Siracusa M., Ruzzi A., Gorbi S., Ercolessi M., Cosentino M. A., Ammazzalorso P., Orletti R. (2015). Two-year study of lipophilic marine toxin profile in mussels of the North-central Adriatic Sea: First report of azaspiracids in Mediterranean seafood. Toxicon, n. 108, pag. 115-125.
Gorbi S., Avio G. C., Benedetti M., Totti C., Accoroni S., Pichierri S., Bacchiocchi S., Orletti R., Graziosi T., Regoli F. (2013). Effects of harmful dinoflagellate Ostreopsis cf. ovata exposure on immunological, histological and oxidative responses of mussels Mytilus galloprovincialis. Fish and shellfish Immunology, n.35(3), pag. 941-950.
Gorbi S., Bocchetti R., Binelli A., Bacchiocchi S., Orletti R., Nanetti R., Raffaelli F., Vignini A., Accoroni S., Totti C., Regoli F. (2012). Biological effects of palytoxin-like compounds from Ostreopsis cf. ovata: a multibiomarkers approach with mussels Mytilus galloprovincialis. Chemosphere, n. 89(5) pag. 623-632.
Jauffrais T., Marcaillou C., Herrenknecht C., Truquet P., Séchet V., Nicolau E., Tillmann U., Hess P. (2012). Azaspiracid accumulation, detoxification and biotransformation in blue mussels (Mytilus edulis) experimentally fed Azadinium spinosum. Toxicon, n. 60(4), pag. 582-595.
Rossi R., Dell'Aversano C., Krock B., Ciminiello P., Percopo I., Tillmann U., Soprano V., Zingone A. (2016). Mediterranean Azadinium dexteroporum (Dinophyceae) produces six novel azaspiracids and azaspiracid-35: a structural study by a multi-platform mass spectrometry approach. Analytical and Bioanalytical Chemistry, n. 409(4), pag. 1121-1134.
Bacchiocchi et al., 2016. Presenza di azaspiracidi nei mitili dell'Adriatico:
metodi di identificazione delle tossine e studio dei potenziali rischi ecotossicologici. (SPVet.it 99/2016)
