Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 99, Dicembre 2016 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
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Amplificazione e clonaggio del gene codificante l'enterotossina CPE del Clostridium perfringens e valutazione di una sua potenziale espressione in sistema eterologo
Amplification and cloning of the gene encoding the enterotoxin CPE of Clostridium perfringens and evaluation of its potential expression in heterologous system

Anna Serroni, Silvia Tofani, Francesca Romani Massacci, Giulio Severi, Antonio De Giuseppe


Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche





Abstract. Clostridium perfringens is one of the most common agents responsible for food poisoning and it is counted among the most important anareobic pathogens for humans and animals. The virulence of this gram-positive bacterium is due to its ability to produce four major toxins α, β, ε, ι. Moreover, the various strains of C. perfringens can synthesize other enterotoxins, named minors, among which must be considered CPE enterotoxin. This toxin causes food poisoning with symptoms typical of type A C. perfringens; in addition, the CPE appears to be involved in other important gastrointestinal diseases in human and veterinary medicine. The aim of this research project was to evaluate the in vitro synthesis of C. perfringens CPE toxin. Two non-toxic delete and mutated recombinant CPE having the 6xHis tag in the amino-terminal (r-H6CPE48-51Δ305) and carboxyl-terminal part (r-CPE48-51Δ305H6) respectively, were expressed in the baculovirus system. Their characterization, using indirect immunoenzymatic tests, revealed the presence of potential dimeric and multimeric forms in both recombinant antigens. To improve the amount of recombinant antigen, other 3 baculovirus (expressing the r-CPE48-51Δ305H6) equipped with three different gene expression regulatory regions located upstream of the ATG start codon of the CPE, were generated. In agreement with the previous results, the new clones expressed protein patterns identical to the previous, but with a significant improvement of the production. Finally, from a quantitative comparison among the three clones, the clone expressing the LD-CPE48-51Δ305H6 seemed to produce the highest level of recombinant antigen. It remains to evaluate the immunogenic capacity of deleted/mutated recombinant CPE, its hypothetical use for the production of poly-monoclonal antibodies for the preparation of enzyme immunoassays

Riassunto. Il Clostridium perfringens è uno dei più comuni agenti responsabile di intossicazioni alimentari ed è annoverato tra i più importanti agenti patogeni anaerobi per l'uomo e gli animali. La virulenza di questo batterio gram-positivo è legata alla sua abilità di produrre 4 principali tossine α, β, ε, ι. Oltre a queste, i vari stipiti di C. perfringens possono sintetizzare altre enterotossine, denominate minori, tra le quali va annoverata l'enterotossina CPE. Questa tossina causa un'intossicazione alimentare con sintomatologia tipica del C. perfringens di tipo A; inoltre la CPE appare anche essere coinvolta in altre importanti patologie gastrointestinali in ambito umano e veterinario. Scopo del presente progetto di ricerca è stato quello di valutare la sintesi in vitro della proteina CPE del C. perfringens. Sono state così espresse, in sistema baculovirus, due CPE ricombinanti delete e mutate atossiche aventi il tag 6xHis; la prima nella parte amino-terminale (r-H6CPE48-51Δ305) e la seconda in quella carbossi-terminale (r-CPE48-51Δ305H6). La loro caratterizzazione, attraverso l'impiego di test immunoenzimatici indiretti, ha evidenziato la presenza di potenziali forme dimeriche e multimeriche in entrambi gli antigeni ricombinanti. Per migliorare la resa dell'antigene ricombinante, sono stati generati altri 3 baculovirus (esprimenti sempre la r-CPE48-51Δ305H6) muniti di tre differenti regioni regolatorie l'espressione genica, poste a monte dello ATG start codon della CPE. In accordo con i precedenti risultati, tutti e tre i cloni hanno espresso pattern proteici quasi del tutto identici ai precedenti ma con un netto miglioramento delle performance produttive. Infine, da una comparazione quantitativa fra i tre cloni, quello esprimente la LD-CPE48-51Δ305H6 si è rivelato essere il baculovirus in grado di produrre il maggior livello di antigene ricombinante. Resta ancora da valutare il potere immunogeno della CPE deleta/mutata ricombinante ed in caso di esito positivo, tale presidio immunizzante potrebbe essere impiegato per la produzione di anticorpi poli-monoclonali, fondamentali per l'allestimento di test immunoenzimatici



Introduzione
Il C. perfringens è un batterio Gram-positivo anaerobio sporigeno, capace di produrre almeno 16 differenti tipi di tossine, quattro delle quali definite "maggiori" (α, β, ε, ι), mentre le rimanenti sono definite come tossine minori. Tra quest'ultime, l'enterotossina CPE, prodotta da alcuni ceppi appartenenti ai tossinotipi A, C, D ed E, causa gastroenteriti di origine alimentare piuttosto rilevanti in ambito umano e veterinario (Sparks et al., 2001; Lahti et al., 2012). La CPE, una proteina di 36 kDa, è codificata da un gene localizzato sia a livello plasmidico sia cromosomico (Vicki Adams et al., 2013). L'azione patogena della CPE si esplica attraverso un processo multistep; la fase iniziale è mediata da un dominio di circa 30 amino-acidi localizzati nella regione carbossi-terminale della proteina (Yelland et al., 2014). L'effetto citotossico richiede, poi, sequenze amino acidiche localizzate nella regione amino-terminale, che determinano la formazione di pori proteici di membrana responsabili dell'alterata permeabilità (Vicki Adams et al., 2013, Yelland et al., 2014) e conseguente morte cellulare.
Lo scopo del presente lavoro è stato quello di valutare la sintesi e l'espressione in sistema eterologo della proteina enterotossica CPE del C. perfringens. Come tecnologia di espressione è stato scelto il sistema baculovirus FlashBac, il quale rappresenta non solo uno dei sistemi biotecnologicamente più avanzati per l'espressione in vitro delle proteine ricombinanti, ma anche quello con il più elevato grado di biosafety.
Sulla base di quanto riportato in letteratura e considerata la tossicità della CPE, si è proceduto al clonaggio di un gene mutato e deleto nelle regioni responsabili della tossicità della stessa (Harada et al., 2007; Smedley et al., 2004, 2007). Nel complesso la ricerca è stata espletata in tre distinte fasi; nella prima è stata espressa una forma della CPE atossica con il tag 6xHis fuso in frame nella parte amino-terminale (proteina r-H6CPE48-51Δ305). Nella seconda parte della ricerca, al fine di aumentare i livelli espressivi e per verificare i risultati ottenuti precedentemente, è stata sintetizzata una CPE ricombinante in cui il tag 6xHis è stato inserito in frame nella parte carbossi-terminale della molecola proteica (proteina r-CPE48-51Δ305H6). Nella terza ed ultima parte della ricerca ed in considerazione che i risultati non sono stati completamente in linea con quanto atteso, il gene esprimente la CPE deleta e mutata atossica è stato munito di in tre differenti regioni regolatorie dell'espressione genica (codificanti sempre la proteina r-CPE48-51Δ305H6), sempre allo scopo di aumentare le quantità di proteina sintetizzata dalle cellule d'insetto (Sano et al., 2002).

Materiali e Metodi
I primers impiegati nelle procedure di clonaggio relative a questo progetto, sono stati disegnati in modo tale da apportare due mutazioni puntiformi ed una delezione della regione carbossi-terminale tali da rendere la CPE sintetica priva di tossicità. Ulteriori primers sono stati disegnati apportando modifiche nelle regioni potenzialmente coinvolte nell'espressione genica e poste subito a monte dello ATG start codon. In tutte le fasi sperimentali a carattere biomolecolare, il gene cpe deleto/mutato è stato amplificato mediante l'impiego della PCR ed inserito in frame con il tag 6xHis al fine di facilitare la purificazione degli antigeni di interesse. In particolare sono stai generati cinque differenti costrutti (con clonaggio degli amplificati nel vettore per baculovirus pOET2C-6xHis) dei quali uno con il tag 6xHis in frame nella regione amino-terminale e quattro con il tag 6xHis inserito all'estremità carbossi-terminale del gene cpe deleto/mutato (stesso ed identico gene ma con quattro differenti sequenze nucleotidiche regolatorie). I costrutti ottenuti sono stati analizzati per mappa di restrizione e sequenziati. I baculovirus ricombinanti sono stati ottenuti a seguito della co-trasfezione delle cellule d'insetto Sf21 con i plasmidi recanti i geni di interesse e il DNA bacmidico. Le proteine espresse sono state analizzate e caratterizzate in Western blot impiegando l'anticorpo monoclonale anti-6xHis.
Gli antigeni prodotti sono stati sottoposti ad estrazione e purificazione attraverso l'impiego della cromatografia per affinità (Ni2+ affinity chromatography); i prodotti purificati sono stati rianalizzati mediante Western blot impiegando il medesimo anticorpo anti-6xHis.

Risultati
Nella presente ricerca è stato condotto un lavoro al fine di sviluppare una procedura per la produzione dell'enterotossina ricombinante atossica CPE mutata e deleta nel sistema baculovirus. Nella fase iniziale è stato generato un baculovirus ricombinante capace di esprimere la proteina r-H6CPE48-51Δ305 in cui sono state inserite le mutazioni D48A, I51A, la delezione degli ultimi 14 amino-acidi (Δ306-319) ed il tag 6xHis alla parte amino terminale. Sorprendentemente, l'analisi in Western Blot ha rivelato bande immunoreattive di circa 40-41 kDa, invece di quella attesa di 36 kDa, sia nel lisato cellulare che nel surnatante delle Sf21 (Figura 1). Anche la quantità di proteina sintetizzata si è attestata su un livello piuttosto limitato anche se, in apparenza superiore a quello riscontrato nel sistema d'espressione procariotico E. coli.

Caratterizzazione in Western blot delle CPE ricombinante espressa in cellule d'insetto Sf21 mediante il MAb anti-6xHis
Figura 1. Caratterizzazione in Western blot delle CPE ricombinante espressa in cellule d'insetto Sf21 mediante il MAb anti-6xHis. Linea 1,
lisato Sf21 esprimenti la CPE ricombinante; linea 2, sovranatante Sf21 non infette (controllo negativo); linea 3, Marker SeeBlue Plus
(il PM è riportato in kDa sulla sinistra della figura); linea 4, estratto cellulare Sf21non infette (controllo negativo); linea 5,
sovranatante Sf21contenente la CPE ricombinante; proteina β2 ricombinante purificata (controllo positivo).


I risultati ottenuti attraverso la colorazione del gel con Coomassie sulle frazioni proteiche purificate in condizioni native, hanno evidenziato l'assenza di una banda proteica attesa (banda da 40-41 kDa) e la presenza di una banda proteica netta con un peso molecolare superiore ai 64 kDa (compresa tra i 70 e gli 80 kDa) (Fig. 2), tra l'altro reattiva con il MAb anti-6xHis (dato non mostrato).

Espressione e purificazione della r-H6CPE48-51?305 espressa in cellule d'insetto Sf21 e colorazione del gel elettroforetico con Comassie
Figura 2. Espressione e purificazione della r-H6CPE48-51δ305 espressa in cellule d'insetto Sf21
e colorazione del gel elettroforetico con Comassie. Lisato cellulare prima e dopo il passaggio
sulla colonna cromatografica (linee t0 e dp); wash (linea W); 1a, 2a e 3a frazione di eluizioni
(linee E1, E2, ed E3); Marker per PM (linee M).


Nella seconda fase sperimentale, nel tentativo di migliorare l'espressione e per confermare la veridicità dei precedenti risultati, è stato generato un nuovo baculovirus ricombinante capace di esprimere la r-CPE48-51Δ305H6 con il tag 6xHis inserito nella regione carbossi-terminale.
I primi test immunoenzimatici effettuati al fine di valutare la tipologia dell'antigene, hanno evidenziato risultati solo in parte in accordo con i precedenti. In effetti al di là della presenza della banda immunoreattiva con peso molecolare superiore ai 64 kDa, appariva evidente anche la presenza di una ulteriore banda con peso molecolare > 190 kDa. Da notare che la banda di 40-41 kDa osservata nei precedenti test non era più evidenziabile con il MAb anti-6xHis (Fig. 3). In aggiunta, i livelli di espressione della r-CPE48-51Δ305H6 non sembravano essere superiori rispetto a quelli riscontrati con il precedente clone. Infine, anche in questo caso le quantità di prodotto purificato sono apparse piuttosto contenute (dato non mostrato).

Caratterizzazione in Western blot della r-CPE48-51?305H6 espressa in cellule d'insetto Sf21 mediante il MAb anti-6xHis
Figura 3. Caratterizzazione in Western blot della r-CPE48-51?305H6 espressa in cellule d'insetto Sf21
mediante il MAb anti-6xHis. Linea 1, lisato Sf21 esprimenti la r-CPE48-51?305H6; linea 2,
sovranatante Sf21 non infette (controllo negativo); linea 3, proteina ?2 ricombinante purificata
(controllo positivo); linea 4, estratto cellulare Sf21 non infette (controllo negativo);
Marker SeeBlue Plus (il PM è riportato in kDa sulla sinistra della figura).


Per chiarire quali tra i due baculovirus ricombinanti fosse in grado di produrre la maggior quantità di proteina, è stato effettuato un test di espressione condotto, ovviamente, nelle medesime condizioni sperimentali in differenti terreni colturali. La Figura 4 evidenzia che i livelli di sintesi dei due baculovirus sostanzialmente sono molto simili tra di loro e con un pattern immunoreattivo sovrapponibile. In aggiunta, le quantità di antigene espresso non sembra variare a seconda del tipo di terreno colturale utilizzato. Un dato ex novo emerso in queste prove sperimentali, rispetto alle precedenti, riguarda una nuova banda immunoreattiva dotata di un peso molecolare orientativamente intorno ai 150-160 KDa. Degno di nota è che nel terreno Grace's addizionato di siero fetale delle Sf21 infettate con entrambi i baculovirus compariva, anche se in quantità estremamente ridotte, la banda immunoreattiva con PM intorno ai 40-41-kDa (indicata dalla freccia nella Fig. 4).

Caratterizzazione in Western blot dell'espressione della r-H6CPE48-51?305 e della r-CPE48-51?305H6 espressa nei diversi terreni colturali mediante il MAb anti-6xHis
Figura 4. Caratterizzazione in Western blot dell'espressione della r-H6CPE48-51Δ305 e della r-CPE48-51Δ305H6
espressa nei diversi terreni colturali mediante il MAb anti-6xHis. Lisato cellulare e sovranatante SF21 in
terreno SFX (linee 1-2 e 7-8); lisato cellulare e sovranatante SF21 in terreno Grace's addizionato di FBS
al 10% (linee 3-4 e 9-10); lisato cellulare e sovranatante SF21 in terreno ECX (linee 5-6 e 11-12);
proteina β2 ricombinante purificata (controllo positivo linea 13); Marker SeeBlue Plus (il PM è
riportato in kDa sulla sinistra della figura).


Nella terza ed ultima fase sperimentale, in considerazione che la resa dei prodotti purificati non è stata in linea con quanto sperato e sempre nel contesto di migliorare le performance produttive, sono state apportare modifiche nelle regioni regolatorie dell'espressione genica. I prodotti di espressione dei tre nuovi baculovirus dotati di tre differenti regioni leader a monte dello ATG start codon ed esprimenti la medesima proteina r-CPE48-51Δ305H6 (denominate per distinzione L-CPE48-51Δ305H6, LD-CPE48-51Δ305H6 e β-CPE48-51Δ305H6) sono stati sottoposti ad analisi in Western blot. In accordo con i precedenti risultati, con l'eccezione della comparsa di una nuova banda immunoreattiva (solo nel lisato cellulare) con peso molecolare intorno ai 35 kDa (Figura 5 freccia inferiore), tutti e tre i cloni hanno espresso bande proteiche con elevato peso molecolare. Infine da una comparazione quantitativa fra i tre cloni, il baculovirus esprimente la LD-CPE48-51Δ305H6 è sembrato essere quello che produceva il maggior livello di antigene ricombinante.

Analisi in Western blot dell'espressione della ?-CPE48-51?305H6, L-CPE48-51?305H6 e LD-CPE48-51?305H6
Figura 5. Analisi in Western blot dell'espressione della β-CPE48-51Δ305H6, L-CPE48-51Δ305H6 e LD-CPE48-51Δ305H6.
Lisato cellulare e sovranatante delle Sf21 esprimenti la proteina β-CPE48-51Δ305H6 (linee 1 e 2); lisato cellulare
e sovranatante delle Sf21 esprimenti la proteina L-CPE48-51Δ305H6 (linee 3 e 4); estratto cellulare e sovranatante
delle Sf21 esprimenti la proteina LD-CPE48-51Δ305H6 (linee 5 e 6); Marker SeeBlue Plus (linea 7); proteina ricombinante
Beta2 purificata (controllo positivo).


Discussione e conclusioni
I dati emersi in questo progetto di ricerca hanno principalmente messo in risalto il fatto che le proteine ricombinati delete/mutate r-H6CPE48-51&DElta;305 e r-CPE48-51Δ305H6 atossiche possono essere espresse in sistema baculovirus e purificate mediante cromatografia per affinità. Quantitativamente l'espressione della ipotetica CPE ricombinante in cellule d'insetto Sf21, sembra essere superiore alla quella riscontrata nel sistema d'espressione procariotico E. coli e nelle colture dei ceppi di C. perfringens. Nonostante i risultati nel complesso apparivano incoraggianti, restava comunque il dubbio che i prodotti proteici con elevato peso molecolare osservati potessero corrispondere alla CPE ricombinante. Tali risultati, apparentemente insoliti, in realtà si sono dimostrati essere in linea con quanto riportato in letteratura da diversi autori.
Infatti, l'enterotossina CPE è in grado di aggregare in forme multimeriche quando sottoposta a SDS-PAGE. In aggiunta, un'attenta analisi evidenzia che le bande immunoreattive con medio ed elevato peso molecolare possono corrispondere a forme dimeriche (banda compresa tra i 70 e gli 80 kDa), tetrameriche (banda con peso molecolare intorno ai 150-160 KDa) e multimeriche (banda > 190 kDa) della CPE deleta/mutata ricombinate (peso molecolare del monomero di circa 40 kDa). Rimane ancora da valutare e stabilire se la resa di tali prodotti proteici può essere ulteriormente migliorata.

In conclusione i risultati ottenuti in questo lavoro sperimentale possono ritenersi piuttosto soddisfacenti ed in aggiunta hanno posto le basi per ulteriori studi sperimentali espletabili in futuri progetti di ricerca. In quest'ottica e qualora tale presidio sintetico si dimostrasse capace di indurre una risposta immunitaria efficace, diventerebbe fatto concreto un suo impiego per la produzione di anticorpi poli-monoclonali potenzialmente impiegabili per l'allestimento di un kit ELISA. Ciò rappresenterebbe il raggiungimento di un obiettivo molto più ambizioso rappresentato dalla possibilità di offrire un ulteriore e valido mezzo per l'individuazione ed il contenimento della clostridiosi nell'ambito della sanità pubblica veterinaria ed umana.

Bibliografia

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OPEN REVIEW - Modulo per la "revisione aperta" di questo articolo, pubblicato sul numero 99/2016 di SPVet.it



Serroni et al., 2016. Amplificazione e clonaggio del gene codificante l'enterotossina CPE del Clostridium perfringens e valutazione di una sua potenziale espressione in sistema eterologo
Serroni et al., 2016. Amplificazione e clonaggio del gene codificante l'enterotossina CPE
del Clostridium perfringens e valutazione di una sua potenziale espressione in sistema eterologo. (SPVet.it 99/2016)



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