Biblioteca Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 99, Dicembre 2016 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
Documento reperibile all'indirizzo: http://spvet.it/indice-spv.html#645
Progetto di ricerca per la valutazione della sopravvivenza di Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ai processi di trasformazione del latte ovino
Research project for the evaluation of
Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis survival to the cheese manufacturing process of sheep's milk
Antonella Di Paolo1, Sara Corneli1, Roberta Ortenzi2, Carla Sebastiani3, Marcella Ciullo3, Giuliano Spaccini2, Massimo Biagetti3, Andrea Valiani2, Giovanni Pezzotti1, Giuliana Cammi4, Norma Arrigoni4, Carmen Maresca5, Piera Mazzone1
1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Area SC3 Ricerca e Sviluppo - Centro Studio e Ricerca Patogeni Emergenti
2 Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Area SC5 Igiene delle produzioni - Centro Servizi alle produzioni
3 Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Laboratorio di Biologia Molecolare
4 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna - Centro di Referenza Nazionale per la Paratubercolosi
5 Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Osservatorio Epidemiologico Veterinario
Abstract. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) is the causative agent of a chronic proliferative enteritis, typical of ruminants, known as Paratuberculosis (PTB) or Johne's Disease (JD). The disease is widespread all over the world, in Italy is present in cattle, goats, sheep, buffalo and some species of wild ruminants. Clinical signs of PTB are a slowly progressive wasting and diarrhoea, that cause serious negative effects in the farm, both in terms of drop in milk production that of losses of animals with clinical forms. In infected animals MAP is primarily excreted through the faeces but it can be present in all the secretions, including milk, also during the sub-clinical stage of the disease. PTB, in addition to strictly livestock-sanitary issues, arouses attention in terms of public health, having been advanced by several years the hypothesis of a MAP involvement in Crohn's disease (CD) of man. Although there is still no conclusive evidence to support the association between MAP and CD, human exposure to MAP through dairy products has become a concern. In Italy at the moment there are no studies on the effectiveness of MAP inactivation during the cheese-making processes of traditional cheese from sheep. The Institute Zooprofilattico of Umbria and Marche, in a Research Project funded by the Italian Ministry of Health (RCIZSUM15/12), assessed the survival of MAP to the manufacturing process provided in Umbria and Marche regions for the production of Pecorino (typical Italian cheese obtained from sheep milk).
Riassunto. Il Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) è il microrganismo responsabile di una enterite cronica proliferativa, tipica dei ruminanti, nota come Paratubercolosi (PTB) o Johne's Disease (JD). La malattia è diffusa in tutto il mondo, in Italia è presente nei bovini, caprini, ovini, bufalini e varie specie di ruminanti selvatici. La PTB negli animali colpiti provoca diarrea e dimagramento progressivo, arrecando danni elevati all'allevamento, sia in termini di calo della produzione lattea che di perdite di animali con forme cliniche. Negli animali infetti il MAP viene eliminato principalmente attraverso le feci ma può essere presente in tutte le secrezioni, compreso il latte, anche durante la fase sub-clinica della malattia. La PTB, oltre a problematiche di tipo strettamente zootecnico-sanitario, desta attenzione anche in termini di Sanità Pubblica, essendo stata avanzata da diversi anni l'ipotesi di un coinvolgimento di MAP nel determinismo del Morbo di Crohn (CD) dell'uomo. Nonostante non vi sia ancora alcuna prova conclusiva a sostegno dell'associazione tra MAP e CD, l'esposizione umana al MAP attraverso i prodotti lattiero caseari è diventato motivo di preoccupazione. In Italia al momento non esistono studi sull'efficacia d'inattivazione del MAP durante i processi di caseificazione dei formaggi tradizionali di origine ovina, pertanto l'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche, nell'ambito di un progetto di Ricerca Corrente, finanziato dal Ministero della Salute (RCIZSUM15/12), ha valutato la resistenza del MAP ai trattamenti di trasformazione del latte ovino, previsti per i prodotti lattiero caseari umbri e marchigiani.
Razionale della ricerca
La Paratubercolosi è una malattia infettiva e contagiosa propria dei ruminanti sostenuta dal Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP). Il MAP determina una forma di enterite proliferativa a carattere cronico nota come Paratubercolosi (PTB) o Johne's Disease (JD). Gli animali colpiti, contraggono l'infezione in età giovanile ma la patologia diviene clinicamente manifesta soltanto in età adulta (OIE Terrestrial Manual 2014). Il MAP si localizza prevalentemente a livello intestinale, pertanto il materiale infettante di importanza primaria è rappresentato dalle feci. Gli animali infetti possono eliminare con le feci, in maniera continua o intermittente, notevoli quantità di micobatteri, fino a cinquemila miliardi al giorno.
Nelle fasi avanzate di infezione, MAP diffonde a vari organi ed apparati e può essere presente in altri liquidi biologici come il latte, il seme e l'espettorato (Eltholth M.M. et al., 2009). La PTB è ampiamente diffusa in Europa (OIE Terrestrial Manual 2014) e in Italia (Pozzato N, et al. 2011) e probabilmente la percentuale di allevamenti infetti in un territorio dove è presente la malattia può raggiungere il 70% (OIE Terrestrial Manual 2014).
La PTB, oltre alle problematiche di tipo strettamente zootecnico-sanitario, desta attenzione anche in termini di Sanità Pubblica, essendo stata avanzata da diversi anni l'ipotesi di un coinvolgimento di MAP nel determinismo del Morbo di Crohn (CD) dell'uomo (Grant I.R. et al., 2001). Nonostante non vi sia ancora alcuna prova conclusiva a sostegno dell'associazione tra MAP e CD, l'esposizione umana al MAP attraverso i prodotti lattiero caseari è diventato motivo di preoccupazione.
Molti organismi ufficiali che si occupano di Sicurezza Alimentare applicano il principio di precauzione e richiedono di ridurre al minimo il rischio di un ingresso del microrganismo nella catena alimentare (Grant I.R. et al., 2001).
Recentemente Paesi Terzi hanno imposto vincoli commerciali per i prodotti oggetto di esportazione: l'India ad esempio richiede che i prodotti lattiero caseari abbiano subito un trattamento tecnologico di provata efficacia verso MAP. Il MAP oltre ad essere presente nel latte degli animali infetti è stato rilevato anche nei prodotti trasformati; ricerche condotte su formaggi stagionati e semi-stagionati di origine ovina in Inghilterra, Grecia, Repubblica Ceca e Svizzera (Eltholth M.M. et al., 2009), concludono che i trattamenti termici classici non riescono ad abbattere del tutto la presenza del MAP.
Nel panorama produttivo del settore lattiero-caseario italiano, i pecorini rappresentano una realtà di cospicua importanza pari al 3% dei formaggi prodotti in Italia ed esportati nel Mondo, e nell'ambito dei formaggi a pasta dura rappresentano il 7% della produzione nazionale (Istat, indagine annuale sul latte e sui prodotti lattiero-caseari - 2015). Le regioni Umbria e Marche rientrano tra le zone a elevata produzione di formaggi di origine ovina e vantano la presenza di prodotti eccellenti che rientrano nell'elenco dei Prodotti Agroalimentari Tradizionali quali il Pecorino di Norcia.
La qualità, la tipicità e la salubrità delle materie prime costituiscono prerogative essenziali non solo per rimanere sul mercato ma anche per garantire la sicurezza dei consumatori.
A tale riguardo non si può sottacere il rischio che, in allevamenti da latte in cui sia presente la Paratubercolosi in un cospicuo numero di animali, il MAP potrebbe essere presente nel latte e di conseguenza nei prodotti trasformati. Infatti il MAP è presente nel latte degli animali infetti, sia per una escrezione diretta (dalla mammella) che per una contaminazione indiretta
(contatto con feci infette in caso di scarsa igiene in sala mungitura). Inoltre MAP è stato rilevato anche nei prodotti trasformati, in particolare ricerche condotte su formaggi stagionati e semi-stagionati di origine ovina in Inghilterra, Svizzera, Grecia e Repubblica Ceca (Eltholth M.M. et al., 2009) concludono che i trattamenti termici classici non riescono ad abbattere del tutto la presenza del MAP nel prodotto finito.
Per quanto riguarda la capacità di sopravvivenza del MAP ai vari trattamenti previsti per il latte vaccino, da diversi studi è emerso che la temperatura di pasteurizzazione (72°C per 15") non riesce a inattivare il germe, in particolare nel Regno Unito circa il 2% delle confezioni di latte intero pastorizzato in commercio, è risultato positivo al MAP (Grant et al., 2001).
In seguito alla pubblicazione di tali risultati, il governo inglese ha assunto una posizione di tipo precauzionale, nell'ottica di ridurre l'esposizione dell'uomo al microrganismo. Le misure approvate dal ACMSF (Advisory Commitee on the Microbiological Safety of Food, 2000) comprendono anche la proposta, in seguito adottata, di aumentare il tempo di pastorizzazione da 15 a 25 secondi, effettuare monitoraggi sulla qualità e l'efficienza degli impianti e promuovere lo studio di nuove tecnologie alternative per la pastorizzazione del latte destinato al consumo umano.
La tecnica di lavorazione per la produzione di formaggio pecorino a latte crudo fa sì che il latte, non trattato termicamente, coaguli a 37-39°C, con caglio liquido (estratto enzimatico da abomaso di vitello).
La caseificazione, in virtù delle condizioni in cui si svolge (temperatura, pH e microflora), dovrebbe comportare un abbattimento della carica microbica, che permette l'utilizzo e il consumo del prodotto finito. In realtà però, come riportato in letteratura (Eltholth M.M., et al. 2009; Stephan R., et al. 2007; Ikonomopoulos J. et al. 2005), il MAP potrebbe essere in grado di resistere ai trattamenti attuati nelle fasi di caseificazione e stagionatura dei formaggi ovini.
Lo scopo del progetto è quello di verificare la sopravvivenza del MAP ai processi di caseificazione e stagionatura dei formaggi a base di latte ovino, partendo da latte contaminato sperimentalmente con una concentrazione pari a 104 UFC/ml di latte in cisterna (Unità Formanti Colonia), circa 500.000.000 corpi batterici di MAP totali in cisterna da 50 L di latte.
Obiettivi della ricerca
- Messa a punto di metodiche per la ricerca di MAP in campioni di latte e durante le fasi di produzione del formaggio;
- Messa a punto di una Real Time PCR per la quantificazione del MAP;
- Confrontare i risultati della conta in piastra delle UFC (esame batteriologico) con i dati ottenuti con la tecnica di Real Time PCR;
- Verificare l'eventuale abbattimento della carica microbica di partenza andando a valutare la misura della resistenza del MAP al trattamento di caseificazione e stagionatura.
Materiali e metodi
Lo studio è stato effettuato utilizzando latte proveniente da un unico allevamento ovino in cui le indagini sierologiche e la ricerca del MAP nel latte di massa tramite Real Time PCR hanno dato esito negativo negli ultimi due anni. Sono state raccolte tre aliquote di latte di massa di circa 50 L ciascuna, conservate alla temperatura di -20°C fino al momento del loro impiego nelle tre caseificazioni sperimentali.
Lo studio si è svolto secondo le seguenti fasi:
- Allestimento delle colture di MAP per la contaminazione sperimentale del latte e conteggio delle UFC di MAP/ml;
- Produzione di tre lotti di formaggio pecorino a latte crudo con contaminazione sperimentale del latte ovino in cisterna e caseificazione;
- Campionamento (Tempo 0 - Tempo 12);
- Analisi microbiologiche, chimico-fisiche;
- Ricerca di MAP nei prodotti della caseificazione, attraverso:
- Conta delle Unità Formanti Colonia (UFC) di MAP nel latte contaminato, nei prodotti intermedi della caseificazione e nel formaggio a vari stadi di stagionatura, applicando le metodiche in uso presso l'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche su terreni solidi selettivi (Manuale OIE, 2014);
- Real Time PCR per la ricerca di MAP e la valutazione quantitativa del DNA presente, tramite l'utilizzo di una sonda a DNA disegnata sul gene f57, presente in unica copia nel genoma di MAP.
Immagine 1. Fasi della produzione del Pecorino:
A Cagliata, B Rottura della cagliata, C Formatura, D Inizio spurgatura
Immagine 2. Aliquote di Pecorino a differenti giorni di stagionatura:
14 giorni (A), 30 giorni (B), 60 giorni (C), 90 giorni (D).
Prospettive future
La presenza di MAP nel latte crudo e pastorizzato è stato oggetto di numerosi studi che dimostrano che il latte pastorizzato non è sempre MAP-free e che l'efficacia della pastorizzazione nell'inattivazione del MAP dipende dall'iniziale concentrazione del microrganismo nel latte crudo.
Negli allevamenti in cui non è nota la prevalenza interaziendale della PTB ovina, potrebbe essere utile analizzare il latte di massa attraverso le tecniche biomolecolari prima delle ulteriori fasi di trasformazione. Con questi elementi sarà possibile effettuare un'analisi iniziale del rischio di contaminazione da MAP nei prodotti a latte crudo e nei prodotti da latte pastorizzato.
Attualmente, in greggi in cui si presuppone un'alta contaminazione da MAP nel latte crudo (greggi con alta prevalenza di PTB, presenza di casi clinici, scarsa igiene durante la mungitura), si raccomanda di procedere alla pastorizzazione del latte con trattamento termico di 72°C per 25 secondi (piuttosto che i precedenti 15") secondo quanto previsto nel rapporto ACMSF (Advisory Commitee on the Microbiological Safety of Food, 2000).
Bibliografia
Advisory Committee on the Microbiological Safety of Food 2000 "Heat resistance of Mycobacterium avium paratuberculosis in milk at pasteurisation temperatures". https://www.food.gov.uk/multimedia/pdfs/acmsf_annualreport_2000.pdf.
Eltholth M.M., Marsh V.R., Van Winden, S., Guitian, F.J. (2009). Contamination of food products with Mycobacterium avium paratuberculosis: a systematic review. Journal of Applied Microbiology, 107, 1061-1071.
Grant I.R, O'Riordan L.M,. Ball H.J, Rowe M.T., 2001. Incidence of Mycobacterium paratuberculosis in raw sheep and goats' milk in England, Wales and Northern Ireland. Veterinary Microbiology, Volume 79, Issue 2, 20 March 2001, Pages 123-131.
Ikonomopoulos, J., Pavlik, I., Bartos M., Svastova P., Yayo Ayele W., Roubal P., Lukas J., Cook N., Gazouli M. (2005). Detection of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis in retail cheeses from Greece and the Czech Republic. Applied and Environmental Microbiology, 71, 8934-8936.
OIE Terrestrial Manual (2014). Chapter 2.1.11. - Paratuberculosis (Johne's disease).
Pozzato N., Capello K., Comin A., Toft N., Nielsen S. S., Vicenzoni G., Arrigoni N. (2011). Prevalence of paratuberculosis infection in dairy cattle in Northern Italy. Preventive Veterinary Medicine. 2011 Oct 1;102(1):83-6. Epub 2011 Jul 31.
Stephan, R., Schumacher, S., Tasara, T. and Grant, I.R. (2007) Prevalence of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis in Swiss raw milk cheeses collected at the retail level. Journal of Dairy Science, 90, 3590-3595.
Di Paolo et al., 2016. Progetto di ricerca per la valutazione della sopravvivenza
di
Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis ai processi
di trasformazione del latte ovino. (SPVet.it 99/2016)
