Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Webzine Sanità Pubblica Veterinaria - Febbraio 2005. Numero 28 [http://spvet.it]Documento reperibile all'indirizzo: http://spvet.it/indice-spv.html#266
Yersinia enterocolitica: biomolecolar characterization and isolation of strains from foods of animal origin in Umbria - Italy.
Yersinia enterocolitica:isolamento e caratterizzazione biomolecolare di ceppi isolati da alimenti di origine animale nella regione Umbria.
Scuota S., Cibotti S., Zicavo A., Cenci T., *Luzzi I.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale Umbria e Marche,
*Laboratorio patogeni enterici Istituto Superiore di Sanità – Roma.
Summary: The aim of this work is the isolation and the characterization of Yersinia enterocolitica, a pathogenic microrganism whose presence was checked in many food of animal and vegetal origin.
The most important food for the toxinfections spreading is the fresh or transformed pork meat. Studies carried out in slaughtering plants discovered that the principal microrganism’s localization in host are: the tonsils (15-24%) and the gut (4-5%).
In the first 4 months of 2004 the Laboratory of Food Microbiology of Perugia found a significant growth of Yersinia enterocolitica’s isolations from pork flesh respect of the three years period before.
About a 20% of analized food resulted contaminated, when the preceding percentage were about 1-3%.
The contaminated samples were mainly made by pork meat and product containing pork, took from different regional district.
The increasing of isolations caused the interest of Clinical Labs of Umbria in order to evaluate the spreading of microrganism in this area, and to highlight the possible point of contact in food chain between man and animal.
21 bacterium strains isolated from food were analyzed with standard methods
(Istituto Zooprofilattico dell’Umbria e delle Marche – Italy) according to ISO 16240:2003 Normative. It was tested also a human strain.
Serotyping was performed with commercial antisera including the most important human pathogenic bioserotypes.
Antibiotic resistance was evaluated with agar diffusion test, using antibiotics included in ENTERNET protocol.
Serotypes’s molecular characterization was performed with PFGE technique.
Labs methods evidenced the serotype’s variety characterizing this microrganism,
10 strains were not pertaining to used serotypes. Antibiotic essay has allowed to observe a good variability of antibiotic sensibility profiles
also within strains belonging to the same serotype.
The molecular variability was evidenced with PFGE; we observed in fact different profiles within the same serotype and also the contamination by different strains of animals coming from the same plants, like found by other Authors.
The trials confirmed the importance of pork’s meat in Yersinia enterocolitica epidemiology ;
excluding a common source of contamination in various regional district.
PFGE molecular markers’s analysis has determined a great heterogeneity of analyzed strains. This technique revelead like a very good instrument for the sub-typing of this microrganism
Data coming from the Hospitals of Umbria Region do not evidence an increase of gastroenteritis caused by this bacterium.
However this fact could be caused by the under-extimation of microrganism presence
in food. In fact Yersinia’s testing is not a routine analysis, and used methods are effectively little sensitive.
INTRODUZIONE
Yersinia enterocolitica è un patogeno alimentare la cui presenza è accertata in un'ampia tipologia di alimenti. La sua responsabilità nelle infezioni umane è stata riportata con sempre maggiore frequenza a partire dagli anni '60; nei paesi sviluppati, in casi umani di enterite acuta, si stima una presenza di Y. enterocolitica di circa il 2%, a conferma di una stabile persistenza del germe nella casistica delle tossinfezioni alimentari. La diarrea è il sintomo predominante, ma occasionalmente possono comparire severe complicazioni come artriti reattive ed eritema nodoso (5).
Y. enterocolitica è una specie altamente eterogenea che comprende molti biosierotipi, dei quali solo alcuni patogeni per l'uomo (5). Il germe è diffuso in molti alimenti di origine animale e vegetale; tuttavia, le carni suine fresche e trasformate risultano l'alimento più frequentemente chiamato in causa in episodi tossinfettivi ed è stato dimostrato che suini clinicamente sani sono spesso portatori di ceppi patogeni di Y. enterocolitica. (2). Studi effettuati in impianti di macellazione (4, 1) hanno dimostrato che il germe si riscontra nelle tonsille (15-24%) e nel contenuto intestinale (4-5%) di suini regolarmente macellati; in analoghi studi effettuati in Germania è stata osservata una frequenza di isolamento dalle tonsille di suini sani variabile dal 13% al 45% (8); nelle carni fresche di suino tale frequenza è stata stimata intorno al 8-25% (7).
Nel primo quadrimestre del 2004, nel Laboratorio di Microbiologia Alimenti di Perugia, si è assistito ad un aumento significativo (Fig. 1) degli isolamenti di Yersinia enterocolitica da carni suine fresche o lavorate (circa il 20%, a fronte di percentuali del 1-3% osservate nel triennio precedente).
Gli alimenti contaminati da Yersinia enterocolitica erano quasi esclusivamente costituiti da preparazioni di carne di suino, carni fresche di suino e prodotti contenenti carne di suino, prelevati in aziende o esercizi situati in distretti regionali diversi, nell'ambito del Piano di Controllo Regionale degli Alimenti della Regione Umbria (Fig. 2).
Su tali alimenti erano effettuate anche altre determinazioni analitiche di routine (Numerazione della Carica mesofila aerobia, di Coliformi totali e di E. coli, ricerca di Salmonella spp.).
Tale incremento degli isolamenti di Yersinia enterocolitica da alimenti ci ha indotto a sensibilizzare i Laboratori Ospedalieri della Regione per la ricerca routinaria del microrganismo in tutte le coprocolture, nell'ottica di valutare la circolazione di Yersinia spp. nella nostra area territoriale, al fine di fare luce sull'eventuale punto di contatto tra uomo e animale nella circolazione del patogeno.
Sui ceppi isolati è stata eseguita sierotipizzazione, valutazione dell'antibiotico resistenza e PFGE.
MATERIALI E METODI
Ceppi batterici: sono stati esaminati n. 21 ceppi isolati da alimenti. Il ceppo batterico di origine umana è stato inviato da una struttura ospedaliera della Regione.
L'isolamento del germe dalle matrici alimentari è stato effettuato a partire da 25 g di prodotto, cui venivano aggiunti 225 ml di Peptone Sorbitolo Broth; la sospensione era incubata a 22°C per 5 giorni. Dopo trattamento con KOH allo 0,5%, la sospensione era seminata su CIN Agar, incubato a 30°C per 24-48 ore. Sulle colonie sospette era effettuata identificazione biochimica in micrometodo (Rapid 20 E Biomérieux) .
La metodica di isolamento descritta, validata secondo la Norma ISO 16240:2003, viene utilizzata nel laboratorio dell'IZSUM, senza variazioni, ormai da cinque anni.
Sierotipizzazione: è stata eseguita mediante sieroagglutinazione rapida con antisieri O:3, O:5, O:8 e O:9 del commercio (Biogenetics). Tali sierotipi includono i principali biosierotipi patogeni per l'uomo.
Antibiogramma: è stato eseguito secondo la metodica della diffusione in agar (3), utilizzando gli antibiotici previsti dal protocollo ENTERNET (Fig. 3).
PFGE: A cellule batteriche cresciute in TSA, lavate, risospese in soluzione tampone e portate ad una D.O. di 0.5 (a 600 nm) è stata aggiunta proteinasi k (0.5 mg/ml, concentrazione finale). I blocchetti sono stati preparati miscelando la sospensione batterica con agarosio 1% (1:1) e messi nella soluzione di lisi per 2 ore a 55 °C in bagnomaria; quindi lavati (in bagnomaria a 50 °C) 2 volte con acqua distillata sterile e 3 volte con tampone (15 minuti x lavaggio). I blocchetti sono stati digeriti con l'enzima NotI (10.000 U) e incubati a 37 °C overnight; l'elettroforesi è stata eseguita in gel di agarosio all'1% utilizzando un apparecchio CHEF Mapper (BIORAD) alle seguenti condizioni di corsa: gradiente 6 V/cm, angolo 120°, impulsi 1-26 sec, temperatura 14°C, tempo di corsa 21 ore. Dopo l'elettroforesi il gel è stato colorato in bromuro di etidio (10 mg/ml), lavato in acqua distillata e fotografato sotto luce UV. L'elaborazione e la normalizzazione dei profili è stata ottenuta mediante un software dedicato (Bionumerics).
RISULTATI
La presenza di Yersinia enterocolitica nei campioni esaminati era nella maggior parte dei casi associata al riscontro di un'alta carica mesofila (6.2-8.0 log/g), di un alto numero di Coliformi totali (2.9-5.1 log/g), alla presenza di E. coli (1.7-3.15 log/g) e, in due casi, alla presenza di Salmonella spp.
Dai dati forniti dagli Ospedali della Regione Umbria non risulta un aumento dei casi di gastro-enterite sostenuta da Yersinia enterocolitica nel periodo considerato.
Sierotipizzazione: Dei 21 ceppi isolati da alimenti, n. 9 sono risultati appartenere al sierogruppo O:5, n. 2 al sierogruppo O:8 e n. 10 non appartenenti a nessuno dei sierogruppi individuabili con i sieri utilizzati (NT).
Il ceppo di origine umana apparteneva al sierogruppo O:3.
Antibiogramma: Tutti i ceppi sono risultati sensibili a cefotaxime, ciprofloxacina, gentamicina, kanamicina, trimetoprim e all'associazione amoxicillina + ac. clavulanico. L'80.95% dei ceppi ha manifestato resistenza verso cefalotina e, di questi, il 47.62% anche verso l'ampicillina. Solo due ceppi sono risultati multiresistenti: un sierotipo O:5 isolato da salsiccia (str.S-3.tet.cf) e il ceppo umano (nal.amp.clo.str.S-3.)
Si osserva comunque una discreta variabilità dei profili di sensibilità agli antibiotici, anche nell'ambito di ceppi appartenenti allo stesso sierotipo.
La variabilità osservata nei profili di sensibilità agli antibiotici è sostanzialmente confermata dai risultati ottenuti con la PFGE: nell'ambito dei ceppi appartenenti al sierogruppo O:5 si osservano infatti profili diversi, ad eccezione dei profili riportati nelle lanes 5 e 9, che si riferiscono a due ceppi isolati da salsicce fresche, prelevate comunque in distretti regionali differenti. Risultano diversi tra loro anche i profili elettroforetici dei due ceppi appartenenti al sierotipo O:8.
Nell'ambito dei ceppi NT ci sono 3 ceppi con lo stesso profilo (lanes 19, 20 e 25) e altri due ceppi uguali tra loro (lanes 21 e 28) che sono stati isolati da carni fresche prelevate nella stessa struttura in tempi diversi; in tale struttura sono stati isolati anche altri stipiti di Yersinia (lanes 10, 27 e 31) non correlati con i precedenti né fra di loro; questo conferma che le carni crude possono essere contaminate contemporaneamente da stipiti differenti di Yersinia, in analogia a quanto riscontrato da altri autori (7)
Nessuno dei ceppi isolati da alimenti ha un profilo simile all'unico stipite umano saggiato (lane 13).
CONCLUSIONI
Si conferma l'importanza epidemiologica che il suino assume nella diffusione di Yersinia enterocolitica e il ruolo preminente di questa specie animale nella diffusione del germe attraverso gli alimenti.
I risultati delle prove hanno permesso di escludere una fonte di contaminazione comune degli alimenti analizzati, anche in ambito distrettuale.
La percentuale di positività riscontrata nelle tonsille e nel contenuto intestinale di suini regolarmente macellati può rendere ragione del fatto che, durante le procedure di eviscerazione e, non ultimo, durante la visita post mortem, il germe possa facilmente contaminare la carcassa.
La capacità del germe di moltiplicarsi a temperature inferiori a 4°C e di resistere bene al congelamento fa sì che questo patogeno, a differenza di altri, come ad esempio Salmonella, possa sopravvivere agevolmente anche quando viene mantenuta la catena del freddo.
Il riscontro del microrganismo negli alimenti, a livello nazionale, potrebbe essere sottostimato in quanto molti laboratori non effettuano routinariamente la ricerca di Yersinia enterocolitica o perché le metodiche in uso risultano poco sensibili. Un'analoga motivazione potrebbe spiegare la bassa frequenza di gastroenteriti imputate a Yersinia enterocolitica.
Siccome questo germe presenta una grande varietà di biosierotipi, dei quali solo alcuni correlati alla salute umana, i metodi di caratterizzazione genotipica sono di grande aiuto nell'individuazione di questi ceppi e della loro epidemiologia. Tra questi metodi la PFGE si è rivelata, in questi ultimi anni, una delle tecniche migliori, in quanto capace di discriminare diversi tipi di Yersinia enterocolitica, anche all'interno di uno stesso sierotipo (6).
L'alto grado di eterogeneità dei profili ottenuti con la PFGE, conferma che questo metodo è molto efficiente nella subtipizzazione di tale microrganismo.
La PFGE per Yersinia enterocolitica, come per altri patogeni, rappresenta pertanto un efficace strumento di epidemiologia molecolare.
BIBLIOGRAFIA
1. Allegra A. M., Fezia G., Fontana E., Roceri M., Sommariva M., Tinelli F. Indagine sulla presenza di Yersinia enterocolitica in suini macellati (2003). Il Progresso Veterinario. LVIII(3), 118-122.
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3. Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. American Journal of Clinical Pathology (1966) 45 (4):493–496.
4. Bonardi S., Brindani F., Pizzin G., Lucidi L., D'Incau M., Liebana E. and Morabito S. Detection of Salmonella spp., Yersinia enterocolitica and verocytotoxin-producing Escherichia coli O157 in pigs at slaughter in Italy.(2003). International Journal of Food Microbiology, 85 (1-2), 101-110.
5. Bottone E.J. Yersinia enterocolitica: overview and epidemiologic correlates.
(1999) Microbes and infection. 1, 323-333.
6. Filetici E., Anastasio M.P., Pourshaban M and Fantasia M. Genotypic and phenotypic characteristics of Yersinia spp. isolates from food and man (2000) Food Microbiology. 17(3), 261-267
7. Fredriksson-Ahomaa M., Koch U., Klemm C., Bucher M. and Stolle A. Different genotypes of Yersinia enterocolitica 4/O:3 strains widely distributed in butcher shops in the Munich area (2004). International Journal of Food Microbiology. 95(1), 89-94.
8. Fredriksson-Ahomaa M., Björkroth J., Hielm S. and Korkeala H. Prevalence and characterization of pathogenic Yersinia enterocolitica in pig tonsils from different slaughterhouses (2000). Food Microbiology. 17(1), 93-101.
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