Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Webzine Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 48, Giugno 2008 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
Documento reperibile all'indirizzo: http://www.spvet.it/arretrati/numero-48/001g.html

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Zoonosi alimentari ad eziologia virale: aspetti epidemiologici e diagnostici dei norovirus



Cesarini F.

INTRODUZIONE
I Norovirus sono piccoli virus con genoma a RNA costituito da un singolo filamento a polarità positiva, senza envelope e di dimensioni modeste (27-35 nm).
Il Genrere Norovirus presenta un'elevata variabilità genetica, che permette di distinguerlo in cinque genogruppi (GI, GII, GIII, GIV, GV) per un totale di trenta genotipi.
Solo i genogruppi GI, GII e GIII sono in grado di infettare l'uomo. Caratteristica importante presentata dal Norovirus è la grande stabilità ambientale, questa caratteristica permette al virus di sopravvivere negli alimenti a temperature maggiori di 60° C e inferiori a 0°C, e perfino a forti disinfettanti ambientali come il cloro fino alla concentrazione di 100 ppm.

I Norovirus fanno parte di un gruppo di virus che provocano gastroenteriti (insieme ai Rotavirus, Adenovirus e Sapovirus). Nel presente lavoro ci occuperemo di questo agente patogeno per la sua ampia diffusione e per l'importanza nel determinare le zoonosi alimentari ad eziologia virale, cioè quelle patologie che possono colpire l'uomo in seguito all'ingestione di alimenti contaminati da virus.

ALIMENTI POTENZIALMENTE INFETTI
Gli agenti virali che si ritrovano negli alimenti sono spesso causa di gastroenteriti. Arrivano sulle nostre tavole attraverso alimenti contaminati come frutta, verdure acque e bevande soprattutto frutti di mare (mitili) come ostriche e cozze consumati crudi o poco cotti.
I frutti di mare si nutrono attraverso la filtrazione di acqua; quindi in caso di presenza di Norovirus o di altri microorganismi, questi sono accumulati a livello dell'epatopancreas dell'animale.
Invece per quanto riguarda la contaminazione di ortaggi essa deriva principalmente dall'acqua usata per l'irrigazione che può contenere materiale fecale e quindi le particelle virali.

L'elevata stabilità ambientale di Norovirus, le contaminazioni fecali delle acque e la bassa dose infettante pari a 10 - 100 particelle virali sono alla base dell'elevata diffusione negli ultimi anni di questo virus.

Tabella 1: Norovirus - Possibili vie di contaminazione.
Via oro-fecale - persona / persona
- Alimenti
- Acqua
Aerosol - vomito
- persona / persona
Contatto indiretto - fomiti


Nelle tabella 1 sono riportate le diverse vie di contaminazioni delle più importanti affezioni enteriche ad eziologia virale sostenute da Norovirus.
Sicuramente i cibi e le bevande infetti all'origine (contaminazione primaria) o inquinati durante la manipolazione a causa della scarsa igiene del personale (contaminazione secondaria) sono i principali veicoli del virus per l'uomo (si ricorda che l'uomo durante la malattia generata da Norovirus è in grado di eliminare particelle virali con vomito e diarrea che possono contagiare attraverso Aerosol e contatto indiretto altre persone).

SINTOMATOLOGIA
L'uomo presenta un tempo di incubazione della malattia che varia tra le 15 e le 48 ore. Il sintomo principale che caratterizza l'infezione da Norovirus è il vomito compulsivo accompagnato da crampi addominali, cefalea, diarrea e a volte febbre.
La malattia perdura per circa 48 ore e durante il decorso il rischio di diffusione del virus è elevata fino a 48 ore dopo la fine dei sintomi, perché, come riportato sopra, le particelle virali sono eliminate in elevata quantità con le feci e l'emesi.
La breve durata dei sintomi e le varie difficoltà di diagnosi in molti casi non permettono l'identificazione della malattia; ne deriva una sottostima sull'effettiva diffusione di Norovirus nella popolazione con conseguente difficoltà nella raccolta ed elaborazione di dati epidemiologici.
Tuttavia uno studio condotto nel 2002 (Molecular Epidemilogy of Norovirus Infections in Sporadic Cases of Viral Gastroenteritis Among Children in Northern Italy Medici, M.C., et al. 2006) su bambini del nord-Italia evidenzia che il Norovirus presenta una certa stagionalità come riportato nel grafico 1.


Grafico 1: Stagionalità del norovitìrus (Medici, M.C., et al. 2006)


La situazione temporale delle sindromi da norovirus sarebbe evidente nel corso di tutti i mesi dell'anno, ad eccezione di aprile e giugno. (Medici, M.C., et al. 2006).

METODI DIAGNOSTICI DI LABORATORIO
L'approccio diagnostico usato in virologia è basato sull'isolamento del virus in colture cellulari. I virus appartenenti alla famiglia dei calicivirus non sono in grado di replicare su colture cellulari da qui la difficoltà dell'isolamento (Losio, M. N., Pavoni, E. 2004).
Le prime tecniche usate per la rilevazione di Norovirus nelle feci è stata la Microscopia Elettronica diretta (EM) e l'immunoelettromicroscopia (IEM).
Per visualizzare le particelle virali mediante tali tecniche, tuttavia, la concentrazione del virus nelle feci deve essere intorno alle 110 particelle/ml (Glass, R. I. et al. 2000) e, poiché durante le infezioni da NV è possibile che si abbia un basso livello di rilascio del virus (Thornhill, T. S. et al. 1975), la diagnosi mediante IEM può portare a falsi negativi (Suffredini, E., Auricchio, B., 2004).

Oltre ad una scarsa sensibilità del metodo altri aspetti negativi sono rappresentati dagli elevati costi di gestione e l'inadeguatezza dello strumento per la rilevazione di NV negli alimenti.
Altra tecnica sviluppata successivamente è l'ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), per la rilevazione di Antigeni virali. Tale procedura di facile applicazione (ampia disponibilità in kit commerciali), presenta anche aspetti negativi come la scarsa sensibilità, la rilevazione solo di alcuni stipiti dovuta all'elevata specificità di questa tecnica.
Per questo motivo in campo alimentare la tecnica ELISA per la ricerca di Norovirus è poco utilizzata. Il recente sviluppo di metodiche molecolari per la rilevazione e differenziazione di Norovirus ha facilitato gli studi sulla loro circolazione e permesso diagnosi di gastroenteriti da essi provocate con aumentata sensibilità e specificità (Ando, et al., 1995; Green et al., 1995; Vinjè and Koopmans, 1996; Medici et al. 2005).
Attualmente le tecniche di biologia molecolare rappresentano gli strumenti più utilizzati per la rilevazione di Norovirus nelle feci, campioni alimentari e ambientali.

Queste sono rappresentate da PCR, RT-PCR (Reverse-transcriptase-PCR) e RT-Immuno-PCR.
Attualmente la tecnica più utilizzata è rappresentata dalla RT-PCR. Questa presenta due punti critici: INIBITORI
I principali inibitori sono acidi polisaccaridici e glicogeno. Il glicogeno è uno degli agenti inibitori che può interferire al fine della rilevazione di particelle virali se non correttamente rimosso (Schultz, A. C., et al. 2007).
Glicogeno è presente in maggior quantità nelle ostriche raccolte nei paesi del nord europa nelle stagioni invernali (Schultz, A. C., et al. 2007).

Il metodo più efficiente di rimozione di acidi polisaccaridici è stato dimostrato con l'utilizzo di RNeasy mini kit, applicando il protocollo di estrazione descritto dal produttore per piante e funghi(Roda de Husman, A. M., et al. 2007). Questo kit disponibile in commercio serve per l'estrazione dell'RNA dal surnatante ottenuto nella fase preparativa del campione.

L'utilizzo di questo kit consente di raggiungere un'elevata efficienza e l'intera procedura richiede solo 30 minuti (Roda de Husman, A. M., et al. 2007) come mostrato nella tabella seguente.

Tabella 2: Comparazione dei vantaggi e svantaggi dei differenti metodi di estrazione di RNA (Roda de Husman, A. M., et al. 2007)
Metodiche Strumenti Tempo Materiali Efficienza
Estrazione con silicio Procedura "In-house" 1.5 h Incubatore Centrifuga-Eppendorf Non diluito (segnale debole)
Qiashredder-estrazione con silicio Combinazione kit commerciale con procedura "In-house" 1.5h Incubatore
Centrifuga-Eppendorf 		Non diluito (segnale debole)
RNeasy Mini Kit (Qiagen) Kit disponibile in commercio 30 min Incubatore
Centrifuga-Eppendorf		 10 - 4
Ultracentrifuga- RNeasy Mini Kit (Qiagen) Ultracentrifugazione combinata con kit commerciale 2.5h Ultracentrifuga
Incubatore
Centrifuga-Eppendorf		 10 - 4
Cloroformio-PEG precipitazione Procedura "In-house" Circa 6 h Centrifuga-Eppendorf
Incubatore		 10 - 4
(segnale debole)


I PRIMERS
Altro aspetto fondamentale per dare risultati analitici attendibili è la scelta dei primers da utilizzare per l'amplificazione. Il genoma dei Norovirus è diviso in tre frames di lettura (ORFs), specificamente:
Attualmente la tendenza di chi esegue analisi per la rilevazione di Norovirus è di utilizzare primers che codificano per il gene della RNA polimerasi (ORF 1) e del gene per la proteina del capside (ORF 2) che sono le regioni del genoma sufficientemente conservate tra i diversi ceppi.
(Ministero della Salute Linee Guida:Raccomandazione relativa alla ricerca di norovirus negli Alimenti 20/04/2007).

Nonostante ciò, possiamo affermare che la scelta dei primers resta sempre un punto critico nello svolgimento di qualsiasi tipo di PCR. Nella seguente tabella sono riassunti i metodi diagnostici prevalentemente utilizzati.

Tabella 3 Vantaggi e svantaggi dei vari metodi diagnostici
Metodo Vantaggi Limiti
Colture Cellulari  Incapacità di replicare
su linee cellulari attualmente disponibili
EM/IEM Individuazione di tutti stipiti virali -Costoso
-Poco sensibile
ELISA Praticità -Individuazione solo alcuni ceppi
-Poco sensibile
RT-PCR -Risultati in tempi rapidi
-Sensibilità		 -Numero campioni
-Presenza di inibitori


DIFFUSIONE DEL NOROVIRUS (NV)
Il primo contagio accertato da Norovirus fu segnalato nel 1968 nello stato dell'Ohio (USA) in alunni di una scuola elementare. Fornire un quadro epidemiologico di questo virus è alquanto difficile, perché ancora oggi in ambito europeo non è stata riconosciuta nessuna metodica comune per tutti i laboratori che effettuano ricerca di Norovirus.
Altro aspetto cruciale per poter avere un quadro epidemiologico chiaro sono i tempi analitici di risposta.
È necessario, infatti, che questi siano brevi per poter applicare misure preventive, tali da poter controllare la diffusione di un'epidemia. Il ritardo di segnalazioni alle autorità competenti nell'epidemia scoppiata nel Luglio 2005 in un villaggio turistico in Puglia non ha permesso di scoprire quale sia stata la fonte di contaminazione (Rizzo, C., et al. 2007).

Le tossi-infezioni gastroenteriche causate da Norovirus si manifestano in ambiti collettivi e ambienti confinati come mense, ristoranti, case di riposo, scuole, ospedali, villaggi vacanze o navi da crociera.
La principale misura preventiva al fine di limitare la diffusione di Norovirus è di segnalare con tempestività casi di gastroenteriti sospette alle Autorità Sanitarie Locali.
Al fine di monitorare l'andamento dei focolai che provocano gastroenteriti virali nell'uomo l'Istituto Superiore di Sanità partecipa al progetto FBVE (Food-borne viruses in Europe) network finanziato dalla Commissione Europea già da alcuni anni. Nel Settembre 2001, il FBVE network ha istituito un database in rete nel quale tutti i membri del progetto possono segnalare focolai di gastroenteriti virali (Kroneman, A., et al. 2007).

Al progetto FBVE partecipano 26 istituti di 13 Stati membri (UK, Olanda, Danimarca, Finlandia, Francia, Germania, Ungheria, Irlanda, Italia, Norvegia, Slovenia, Spagna e Svezia).

Tabella 4: Numero di Focolai provocati da Norovirus dal 2002 al 2006 nei paesi che partecipano al progetto FBVE(Kroneman, A., et al. 2007)
Focolai per Paese e per anno 2002 2003 2004 2005 2006 tutti i focolai
Germania 216 0 0 2019 3156 5391
Spagna 18 6 4 11 15 54
Finlandia 75 4 16 20 14 129
Francia 103 72 10 69 58 312
Inghilterra 795 219 301 357 221 1893
Ungheria 111 85 63 68 104 431
Irlanda 0 0 31 53 152 236
Italia 2 2 4 6 5 19
Olanda 150 52 124 93 219 638
Norvegia 0 0 0 25 29 54
Svezia 15 7 9 19 28 78
Slovenia 22 10 8 24 22 86
Totale 1523 464 592 2777 4074 9430
Numero di città con focolai 11 10 11 13 13  


Tuttavia la presenza di focolai sostenuti da Norovirus dal 2000 al 2008 è stata segnalata anche nei seguenti paesi riportati nella figura seguente




CONCLUSIONI
Sulla base dei dati disponibili in letteratura si evince che le infezioni da norovirus sono piuttosto diffuse in molti paesi dell'Europa così come in altri continenti.
Nonostante le difficoltà di tipo diagnostico e di tipo epidemiologico connesse ad un livello di sorveglianza piuttosto limitato, si può affermare che l'incidenza di patologie infettive attribuibili ai norovirus appare in costante aumento (Medici, M.C., et al. 2006, Lopman, B., et al. 2006).

Le difficoltà diagnostiche derivano da alcuni aspetti intrinseci all'evoluzione dell'infezione, molto rapida, ed alla bassa carica virale presente nei campioni di diversi materiali patologici o di matrici alimentari destinati ai controlli di laboratorio.
Ciò comporta un approccio sia di tipo diagnostico che epidemiologico basato su criteri di significatività statistica che possono offrire una probabilità diagnostica appropriata.
Un elemento di ulteriore preoccupazione è rappresentato dall'insorgenza di varianti dei norovirus che appaiono dotati di notevole resistenza ambientale e quindi predisposti a diffondere secondo le modalità ormai note e legate a contaminazione alimentari e/o a contatti tra persone infette e persone sane.

La comparsa di genotipi nuovi comporta la necessità di adeguare progressivamente le procedure diagnostiche molecolari al fine di garantire alle prove di PCR un'adeguata specificità. A tale fine risulterà determinante la sempre maggiore specializzazione dei laboratori diagnostici che al fine di applicare metodi diagnostici sempre più sensibili e specifici dovranno provvedere alla tipizzazione degli stipiti virali in circolazione per selezionare coppie di primers che corrispondano a regioni genomiche altamente conservate.

Altro aspetto cruciale è la breve durata della patologia i cui sintomi scompaiono in pochi giorni; questo fa sì che molti soggetti colpiti da norovirus, nella maggior parte dei casi non siano sottoposti ai necessari test diagnostici, o comunque di essere seguiti dalle strutture sanitarie preposte.
Tutto questo determina una non appropriata valutazione epidemiologica delle infezioni da norovirui nell'uomo e la conseguenza derivante è rappresentata da una sottostima degli eventi epidemici che ne conseguono.

Sarebbe inoltre auspicabile che nell'ambito delle normative sanitarie in tema di sicurezza alimentare fosse contemplata la necessità di controlli di laboratorio soprattutto per i molluschi bivalvi mirati non solo ad accertamenti di tipo batteriologico ma anche virologico soprattutto per gli agenti virali maggiormente diffusi come i norovirus.

LAVORI CITATI

Losio, M. N., Pavoni, E. (2004). Ruolo dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale nel controllo dei virus enterici nei molluschi. Rapporti ISTISAN 05/24 Istituto Superiore di Sanità.

Glass, R. I., Noel, J., Ando, T., Fankhauser, R., Belliot, G., Mounts, A., Parashar, U. D., Bresee, J. M., Monroe, S. S. (2000) The epidemiology of enteric caliciviruses from humans: a reassessment using new diagostics. Journal of Infectious Diseases,181 Suppl 2:S254-61

Thornhill, T. S., Kalica, A. R., Wyatt, R. G., Kapikian, A. Z., Chanock, R. M. (1975) Pattern of shedding of the Norwalk particle in stools during experimentally induced gastroenteritis in volunteers as determined by immune electron microscopy. Journal of Infectious Diseases, 132(1); 28-34

Suffredini, E., Auricchio, B., (2004). Determinazione di norovirus in molluschi eduli lamellibranchi. Rapporti ISTISAN 05/24 Istituto Superiore di Sanità.

Ando, T., Monroe, S. S., Gentsch, J. R., Jin, Q. I., Lewis, D. C., Glass, R. I. (1995) Detection and differentiation of antigenically distinct small round-structured viruses (Norwalk-like viruses) by reverse transcription-PCR and Southern Hibridization. Journal of Clinical Microbiology 33; 64-71.

Green, J., Gallimore, C. I., Narcott, J. P., Lewis, D., Brown, D. W. G. (1995) Breadly reactive reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of SRSV-associated gastroenteritis. Journal of Medicine Virology 47;392-398.

Medici, M. C., Martinelli, M., Ruggeri, F. M., Abelli, L. A., Boseo, S., Arcangeletti, M. C., Pinardi, F., De Conto, F., Calderaio, A., Chezzi, C., Dettori, G., (2005) Breadly reactive nested riverse transcription-PCR using an internal RNA standard control for detection of norovirus in stool samples. Journal of Clinical Microbiology 43;3772-3778.

Vinjè, J., Koopmans, M. P. G. (1996) Molecular detection and epidemiology of small round structured viruses in outbreaks of gastroenteritis in the Netherlands. Journal of Infectious Diseases,174;610-616.

Schultz, A. C., Saadbye, P., Hoorfar, J., & Norrung, B. (2007). Comparison of methods for detection of norovirus in oysters. International Journal of Food Microbiology, 114(3), 352-356.

Roda de Husman, A. M., Lodder-Verschoor, F., van den Berg, H. H., Le Guyader, F. S., van Pelt, H., van der Poel, W. H., et al. (2007). Rapid virus detection procedure for molecular tracing of shellfish associated with disease outbreaks. Journal of Food Protection, 70(4), 967-974.

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Medici, M. C., Martinelli, M., Abelli, L. A., Ruggeri, F. M., Di Bartolo, I., Arcangeletti, M. C., et al. (2006). Molecular epidemiology of norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in northern italy. Journal of Medical Virology, 78(11), 1486-1492.

Rizzo, C., Di Bartolo, I., Santantonio, M., Coscia, M. F., Monno, R., De Vito, D., et al. (2007). Epidemiological and virological investigation of a norovirus outbreak in a resort in puglia, italy. BMC Infectious Diseases, 7, 135.

Lopman, B., Gallimore, C., Gray, J., Vipond, I., Andrews, N., Sarangi, J., Reacher, M. , Brown, D. (2006). Linking Healthcare associated norovirus outbreaks: a molecular epidemiologic method for investigating transmission. BMC Infectious Diseases,6,108