Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
Webzine Sanità Pubblica Veterinaria: Numero 54 Giugno 2009 [http://www.spvet.it/] ISSN 1592-1581
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Molecular characterization of Listeria monocytogenes strains isolated in fish market of Umbria (Central Italy): preliminary data - Caratterizzazione molecolare di ceppi di Listeria monocytogenes isolati in una pescheria dell'Umbria: dati preliminari
Crotti S., Gattuso A.(*), Cucci S.(*), Gianfranceschi M.V.(*), Bazzucchi V.(*), Bonanno S., Zicavo A., Scuota S.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Italy.
(*) Istituto Superiore di Sanità - Italy.
Abstract. Listeria monocytogenes is a food borne pathogen associated with severe diseases in humans and animals. In this study we present the molecular analysis of 45 L. monocytogenes strains recovered between January 2005 and December 2008 in a Umbria's fish market during a HACCP system.
The aim of the present study is to identify the pulsotype through "Pulsed-Field Gel Electrophoresis" (PFGE) and the serotype by a multiplex-PCR. PFGE analysis revealed 13 distinct AscI pulsotypes, grouped into 3 pulsogroups, ranged from a minimum of 3 up to 32 isolates. The analysis of all strains showed a homology ranged from a minimum of 73,3% up to 100%. Multiplex-PCR serotyping assay showed 97,8% (44/45) strains belonging to serotype 1/2a and 1,2% (1/45) strains belonging to serotype 1/2c.
At the end of investigation, data obtained will be used to asses the serotype/pulsotype distribution in fish and ready-to-eat fish products to compare their with the other regional and national reports and to evaluate the management system.
Riassunto. Listeria monocytogenes è un patogeno legato ai cibi ed associato con gravi patologie che affliggono sia gli animali che gli esseri umani. In questo studio presentiamo In this study we present the molecular analysis of 45 L. monocytogenes strains recovered between January 2005 and December 2008 in a Umbria's fish market during a HACCP system.
The aim of the present study is to identify the pulsotype through "Pulsed-Field Gel Electrophoresis" (PFGE) and the serotype by a multiplex-PCR. PFGE analysis revealed 13 distinct AscI pulsotypes, grouped into 3 pulsogroups, ranged from a minimum of 3 up to 32 isolates. The analysis of all strains showed a homology ranged from a minimum of 73,3% up to 100%. Multiplex-PCR serotyping assay showed 97,8% (44/45) strains belonging to serotype 1/2a and 1,2% (1/45) strains belonging to serotype 1/2c.
At the end of investigation, data obtained will be used to asses the serotype/pulsotype distribution in fish and ready-to-eat fish products to compare their with the other regional and national reports and to evaluate the management system.
Introduzione
Listeria monocytogenes è l'agente eziologico della listeriosi umana, malattia associata il più delle volte al consumo di alimenti contaminati. E' responsabile di setticemie e di forme invasive, con interessamento del sistema nervoso centrale e del sistema riproduttivo; in questi casi l'infezione è associata ad un tasso di mortalità piuttosto elevato (20-30%) nei soggetti a rischio (Gianfranceschi et al., 2007).
La presenza del germe in diversi tipi di alimento è stata già ampiamente dimostrata, grazie alle sue caratteristiche di crescita. L. monocytogenes infatti è in grado di crescere in un ampio range di temperature (da 1°C fino a 45°C), in condizioni estreme di pH e in presenza di alte concentrazioni di sale (Sleator et al., 2003).
Anche se i casi sporadici ed i focolai epidemici sono associati a diverse matrici alimentari, i prodotti pronti al consumo (RTE), rappresentano la categoria più frequentemente associata ai casi di listeriosi.
I dati del rapporto dell'EFSA relativi all'anno 2007 per diverse classi di alimenti RTE saggiati nei paesi dell'Unione Europea mettono in evidenza come la percentuale di campioni positivi testati per criteri di presenza/assenza di L. monocytogenes vari dallo 0,2% nei prodotti da forno su 496 unità, al 18,3% su 2692 unità nei prodotti di pesce RTE.
I dati del Ministero della Salute riguardanti il sistema di allarme rapido (RASFF, Rapid Alert System for Food and Feed), indicano che le allerte associate alla presenza di L. monocytogenes negli alimenti registrano un trend in crescita nel periodo 2006-2008: da 23 segnalazioni nel 2006, si è passati a 36 segnalazioni nel 2007 e a 47 nel 2008. Delle 47 notifiche di allerta del 2008, 11 riguardano prodotti della pesca.
Nell'ambito dei controlli igienico sanitari previsti dal piano di autocontrollo aziendale, eseguiti tra gennaio 2005 e dicembre 2008 presso una pescheria umbra, è stata effettuata sistematicamente la ricerca di L. monocytogenes.
Scopo del lavoro è stato quello di caratterizzare geneticamente i ceppi di L. monocytogenes isolati, determinandone il pulsotipo, mediante "Pulsed Field Gel Electrophoresis" (PFGE) ed il sierotipo, tramite analisi in PCR.
Al termine dell'indagine, i dati ottenuti serviranno (i) a valutare la distribuzione dei sierotipi nel pesce e nei prodotti della pesca, (ii) a correlare sierotipo e pulsotipo e (iii) compararli con le altre realtà regionali e nazionali.
Essi contribuiranno inoltre a valutare l'aspetto gestionale e sanitario della struttura, monitorandone l'andamento nel corso degli anni per impostare un eventuale piano di sorveglianza laddove si riscontrasse una positività persistente.
Materiali e Metodi
Campioni: sono stati esaminati n. 344 campioni costituiti da pesce RTE, pesce fresco, spezie e tamponi ambientali.
Isolamento ed identificazione dei ceppi di L. monocytogenes: per la ricerca di L. monocytogenes è stato utilizzato il metodo AFNOR BIO 12/11-03/04. I campioni positivi allo screening sono stati confermati secondo quanto previsto dalla UNI EN ISO 11290-1:2005.
Estrazione del DNA genomico: un'ansata di patina batterica cresciuta su TSAYE (Tryptone Soy Broth - Biokar Diagnostics cod.BK046HA; estratto di lievito - Biokar Diagnostics cod. A1202HA; Agar - Biolife cod. 4110302) è stata stemperata in 200 µL di acqua distillata sterile e fatta bollire per 15 minuti. Il DNA genomico così ottenuto è stato impiegato per le analisi di PCR.
PCR per Listeria monocytogenes: il DNA estratto è stato analizzato in PCR per l'identificazione di specie. I primer impiegati nella reazione di PCR sono LL5 (5'-AACCTATCCAGGTGCTC-3') e LL6 (5'-CTGTAAGCCATTTCGTC-3'); essi sono specifici del gene hlyA che codifica per una esotossina batterica (listeriolisina O) coinvolta nel meccanismo patogenetico di L. monocytogenes (Portnoy et al., 1992). La reazione di PCR è stata condotta in accordo al protocollo di Barocci et al. (2008); il prodotto di PCR (227 bp) è stato sottoposto a corsa elettroforetica in gel di agarosio (1,5%), colorato con etidio bromuro (10 ng/ml) e visualizzato mediante Transilluminatore UV.
Sierotipizzazione mediante multiplex PCR: è stata eseguita utilizzando i primer descritti nel lavoro pubblicato da Doumith et al. (2004) che permettono l'identificazione del genere Listeria e la suddivisione dei ceppi appartenenti alla sola specie L. monocytogenes in quattro sierogruppi.
Il sierogruppo I comprende i sierotipi 1/2a e 3a, il sierogruppo II i sierotipi 1/2c e 3c, il sierogruppo III i sierotipi 1/2b, 3b e il sierogruppo IV i sierotipi 4b, 4d e 4e.
La mix di PCR è composta da: PCR Master Mix 1X (Qiagen, Milano, Italia), mix di primer (lmo0737, ORF2819, ORF2110, lmo1118 e prs), H2O penta distillata sterile e il DNA estratto.
Le condizioni della reazione di PCR sono le seguenti: step iniziale di denaturazione a 94°C per 3 minuti, 35 cicli a 94°C per 0.40 minuti, 53°C per 1.15 minuti, 72°C per 1.15 minuti e step finale a 72°C per 7 minuti.
I prodotti di PCR vengono separati mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio al 2,5% e visualizzati al transilluminatore UV dopo colorazione con etidio bromuro (10 ng/ml).
Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE): l'estrazione del DNA, la digestione dei campioni con l'enzima AscI e l'elettroforesi in campo pulsato sono state eseguite secondo il protocollo descritto da Graves and Swaminathan (2001) per il programma PulseNet. Come riferimento per l'analisi dei profili di restrizione viene caricato su ogni gel il DNA genomico di Salmonella Braenderup H9812, digerito con enzima XbaI.
La corsa elettroforetica è stata eseguita utilizzando un sistema CHEF-DR III (Bio-Rad, Hercules, CA) ad un gradiente di 6 V/cm, angolo 120°, uno switch time di 4-40 secondi a 14°C per 21 ore.
Il gel è stato colorato con etidio bromuro e l'immagine acquisita con il sistema di acquisizione immagini Bio-Rad Gel Doc 2000TM (Bio-Rad, Hercules, USA). I profili molecolari sono stati analizzati con il software Bio-Numerics (ver. 4.0; Applied Maths, Saint-Martins-Latem, Belgio) che elabora il dendrogramma mediante l'Underweight-Pair Group Matching Algorithm (UPGMA) a partire da una matrice di similarità ottenuta utilizzando il coefficiente di correlazione Dice con limite di tolleranza e ottimizzazione dell'1,0%.
Risultati
Dai 344 campioni esaminati sono stati isolati n. 45 ceppi di L. monocytogenes; di questi, 25 sono stati isolati da pesce RTE, 18 ceppi sono stati isolati da pesce fresco, 1 ceppo da pepe in grani prelevato dal contenitore in uso e 1 ceppo dall'affettatrice utilizzata per la preparazione dei carpacci.
PCR per L. monocytogenes: tutti i campioni positivi al metodo microbiologico sono stati confermati in PCR (Foto 1).
Sierotipizzazione: la sierotipizzazione dei 45 ceppi di L. monocytogenes è stata eseguita utilizzando una multiplex PCR che permette di separare i 4 maggiori sierotipi (1/2a, 1/2b, 1/2c e 4b) in 4 gruppi distinti. La conferma dei sierotipi all'interno dei singoli sierogruppi è stata effettuata utilizzando la metodica della siero-agglutinazione.
Il 97,8% dei ceppi è risultato appartenere al sierotipo 1/2a (Foto 2), mentre il 2,2% al sierotipo 1/2c (Figura 1).
Foto 1 - PCR per L. monocytogenes
Foto 2 - Multiplex PCR per sierotipizzazione (sierotipo 1/2a)
Figura 1. Distribuzione percentuale dei sierotipi di L. monocytogenes
PFGE
I ceppi tipizzati con la PFGE hanno evidenziato profili di restrizione caratterizzati da un numero di bande compreso tra 12 e 14. Sono stati considerati uguali solo i ceppi con profilo di restrizione indistinguibile sia per il numero che per la posizione delle bande.
I 45 ceppi di L. monocytogenes (43 alimentari, 1 isolato da spezie e 1 ambientale) sono stati suddivisi in 13
pulsotipi (indicati convenzionalmente con i numeri da 1 a 13) e raggruppati in 3 pulsogruppi (Tabella 1), ognuno dei quali costituito da un minimo di 3 ceppi fino ad un massimo di 32, con un livello di similarità ? 90,0%). I pulsogruppi sono stati contraddistinti con le lettere A, B e C in ordine decrescente di numerosità di ceppi.
Tabella 1. Rappresentazione dei pulsogruppi in ordine crescente di numerosità di isolati.
Il pulsogruppo A, il più numeroso dei tre clusters individuati, comprende 32 isolati suddivisi in 6 pulsotipi con un livello minimo di similarità superiore al 95%; questo pulsogruppo comprende anche il ceppo isolato da ambiente e il ceppo isolato da spezie (Figura 2).
Considerando i profili di restrizione di tutti i ceppi, compreso quello che, non presentando alcuna somiglianza significativa con gli altri ceppi, non è stato inserito in alcun pulsogruppo, si osserva una percentuale di omologia tra i profili di restrizione che varia da un minimo del 73,3% ad un massimo del 100%.
In Tabella 2 sono riportati i pulsotipi distribuiti in riferimento al numero di isolati, alla fonte di isolamento e all'anno.
Si può osservare che il pulsotipo più comune, il 9, comprende 14 ceppi: 9 isolati da pesce fresco e 5 isolati da pesce RTE; di questi 4 sono stati isolati nel 2005, 4 nel 2006, 4 nel 2007 e 2 nel 2008, tutti di sierotipo 1/2a.
Il pulsotipo 5, il secondo in ordine di frequenza, comprende 11 ceppi: 3 isolati da pesce fresco e 8 da pesce RTE. Tre sono stati isolati nel 2006, 1 nel 2007 e 7 nel 2008, tutti di sierotipo 1/2a.
Il pulsotipo 1 ed 8 comprendono entrambi 4 ceppi, ma a differenza del pulsotipo 1, che comprende solo isolati della categoria pesce RTE, il pulsotipo 8 rappresenta il raggruppamento più eterogeneo, poiché comprende 3 categorie su 4.
Tabella 2. Pulsotipi in ordine decrescente di numerosità di ceppi.
Figura 2. Dendrogramma dei profili molecolari dei ceppi di L. monocytogenes.
I riquadri A, B e C rappresentano i tre pulsogruppi individuati con livello di similarità
> 90%.
Discussione e conclusioni
I risultati del presente lavoro mostrano che i ceppi di L. monocytogenes isolati da pesce RTE e da prodotti della pesca freschi mostrano una correlazione sierotipo/alimento. Infatti il 97,8% dei ceppi isolati appartengono al sierotipo 1/2a, come già descritto dalla letteratura (Corcoran et al., 2006; Gudmundsdòttir et al., 2005; Dauphin et al., 2001). Un solo ceppo, isolato da hamburger di pesce, appartiene al sierotipo 1/2c.
La caratterizzazione molecolare dei ceppi analizzati ha messo in evidenza come ci sia un'omogeneità di profili fra gli isolati (il livello di similarità di 44 isolati su 45 è di poco inferiore al 90%), ad eccezione del ceppo appartenente al pulsotipo 13, correlato da un livello di similarità del 73,3%.
I nostri dati mostrano che vi è una completa correlazione tra sierotipi e pulsotipi degli isolati analizzati, poichè il 100% dei ceppi con identico pattern PFGE appartiene allo stesso sierotipo.
L'analisi dei sierotipi/pulsotipi ha evidenziato che 10 pulsotipi su 13 sono stati isolati in un arco di tempo limitato ad un anno, mentre tre pulsotipi (9, 5 e 1) sono decisamente ricorrenti in quanto si ripresentano nei diversi anni in cui è stata condotta l'indagine.
Dai risultati ottenuti si può ipotizzare che 44 ceppi di L. monocytogenes derivano da un ceppo progenitore che persiste nell'ambiente dell'esercizio commerciale. Tale ipotesi è avvalorata dalla presenza di unico ceppo di L. monocytogenes di sierotipo 1/2c, con un profilo molecolare differente rispetto agli altri isolati, osservato per la prima volta nel corso del 2008.
Tali dati, pur rappresentando un numero limitato di campioni, danno l'idea della situazione che può presentarsi all'interno di un esercizio commerciale quale una pescheria o più in generale di un'industria alimentare.
Questo risultato conferma che L. monocytogenes può essere introdotta all'interno della linea di processo attraverso le materie prime e persistere sulle superfici di lavorazione e nell'ambiente.
La frequente contaminazione da L. monocytogenes delle materie prime impiegate e la sua presenza sulle superfici ed ambienti di lavoro rendono il rischio di reintroduzione di Listeria nella catena di lavorazione uno dei punti più critici nel controllo di questo microrganismo.
Infatti una persistente colonizzazione ambientale con uno specifico ceppo può rappresentare una sorgente di ripetute contaminazioni durante la lavorazione di un prodotto. E' quindi di fondamentale importanza attuare interventi di sanitizzazione mirati negli impianti di lavorazione degli alimenti e in esercizi commerciali che preparano prodotti pronti al consumo, al fine di evitare una continua contaminazione o possibili cross-contaminazioni fra materia prima/semilavorato e prodotto finito, soprattutto se si tratta di prodotti RTE.
Bibliografia
- Barocci S., L. Calza, G. Blasi, S. Briscolini, M. De Curtis, B. Palombo, L. Cucco, M. Postacchini, M. Sabbatini, T. Graziosi, S. Nardi, G. Pezzotti. 2008. Evaluation of a rapid molecular method for detection if Listeria monocytogenes directly from enrichment broth media. Food Control, 19, 750-756.
- Corcoran D., Clancy D., O'Mahony M., Grant K., Hyland E., Shanaghy N., Whyte P., McLauchlin J., Moloney A. and Fanning S. 2006. Comparison of Listeria monocytogenes strain types in Irish smoked salmon and other foods. Int. J. Hyg. Environ.-Health, 209, 527-534.
- Dauphin G., Ragimbeau C. and Malle P. 2001. Use of PFGE typing for tracing contamination with Listeria monocytogenes in three cold-smoked salmon processing plants. Int. J. Food Microbiol., 64, 51-61.
- Doumith M., Buchrieser C., Glaser P., Jacquet C., Martin P. 2004. Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology, 3819-3822.
- EFSA (2009). The community summary report on trends and source of zoonoses and zoonotic agents in the European union in 2007. The EFSA Journal, 223.
- Gianfranceschi M.V., M.C. D'Ottavio, A. Gattuso, P. Aureli. 2007. Distribuzione di sierotipi e pulsotipi fra ceppi di Listeria monocytogenes raccolti nell'ambito del programma "Listernet Italia" (2002-2005). Atti del VI Workshop Nazionale Enter-net Italia - Le tossinfezione alimentari: sorveglianza e controllo, 47.
- Graves L.M. and Swaminathan B. 2001. PulseNet standardized protocol for subtyping Listeria monocytogenes by macrorestriction and pulsed-field gel electrophoresis. International Journal of Food Microbiology , 65, 55-62.
- Gudmundsdòttir S., Gudbjörnsdòttir B., Lauzon H. L., Einarsson H., Kristinsson K. G. and Kristjànsson M. 2005. Tracing Listeria monocytogenes isolates from cold-smoked salmon and its processing environment in Iceland using pulsed-field gel electrophoresis. Int. J. Food Microbiol., 101, 41-51.
- Ministero della Salute (2009). Relazione sul sistema di allerta comunitario- Anno 2008.
- Portnoy D.A., Chakraborty T., Goebel W, Cossart P. 1992. Molecular determinants of Listeria monocytogenes pathogenesis. Infection and Immunity, 60, 1263-1267.
- Sleator R.D., Gahan C.G.M., Hill C. 2003. A postgenomic appraisal of osmotolerance in Listeria monocytogenes. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1-9.
