Table 3. In blue are shown genetic elements in the analytic chain at the GMO Laboratory IZS UM Perugia, Italy
I metodi per il mais GM T25, DAS59122, MIR604 e per la soia GM A2704-12 e MON89788 sono stati validati anche in Fast PCR quantitativa, con il corrispondente gene taxon-specifico (gene endogeno) LE per soia e ADH1 per mais (European Network of GMO Laboratories [22/07/2011]). La linearità delle reazioni dei sistemi transgenico ed endogeno è stata valutata calcolando il valore medio degli indici R
2 delle rette di regressione. Criterio di accettabilità per la linearità (range dinamico) è espresso dall'R2 che deve essere ≥0.98. L'efficienza di amplificazione è stata misurata per ciascun sistema di amplificazione sfruttando la seguente relazione funzionale:
E(%)= [ (10
-1/slope) -1]x100
Il criterio di accettabilità per l'efficienza di reazione (o amplificazione), prevede un valore medio dello slope (pendenza) della curva di calibrazione compreso nel range -3.6 ≤ slope ≤ -3.1, corrispondente ad un'efficienza di amplificazione tra il 90 e 110%. L'esattezza prevede uno scostamento del ±25% dal valore di riferimento accettato: BIAS ≤ 25% per tutto l'intervallo di quantificazione.
La precisione in condizioni intermedie di ripetibilità, è pari a un RSDr% ≤ 35%.
Dai dati delle qPCR 1, 2, 3 si sono ricavate l'esattezza e la precisione, delle qPCR 1, 3, 4 si sono ricavate l'efficienza di reazione e la linearità, e dai dati della qPCR 1 e 2 (parametro volume) e qPCR 3 e 4 (parametro strumento) è stata valutata la robustezza. I parametri valutati, per tutti e cinque i metodi quantitativi, soddisfano i criteri di accettabilità.
Il LOQ è stato ricavato dall'esperimento eseguito per il LOD ed è stato definito come il numero di copie corrispondente allo scarto tipo relativo di ripetibilità (RSDr) ≤ al 25%, i risultati sono riportati nella tabella 3 (European Network of GMO Laboratories [13/10/2008]).
Duscussione e Conclusioni
I metodi qualitativi e quantitativi oggetto del progetto di ricerca si sono mostrati validi allo scopo, sono stati pertanto portati in estensione e accreditati.
Il progetto ha permesso di integrare la filiera analitica del Laboratorio, con altri 5 eventi GM tutti in modalità Fast, ampliando le competenze tecniche e quindi migliorando le proprie performance in risposta alla continua domanda derivata da un incessante autorizzazione e introduzione di OGM nel nostro Paese.
L'adozione di PCR Real-time in modalità Fast, risulta un valido strumento di miglioramento, in quanto consente di svolgere le analisi in tempi molto più brevi rispetto alla modalità standard, consentendo una riduzione dei costi e dei tempi di risposta, con il rigore necessario all'esecuzione delle prove per identificazione e quantificare gli OGM.
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