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Numero 1/2 febbraio 2001
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La Reazione a Catena della Polimerasi
Cristina Rondini
La reazione a catena della polimerasi (PCR), ideata e realizzata da Mullis e collaboratori nel 1984, ha aperto la possibilita' di intraprendere numerosi nuovi percorsi di studio ed analisi nel settore delle biotecnologie agroalimentari.
La possibilita' di disporre di quantita' virtualmente illimitate di un determinato frammento di DNA, anche quando il materiale di partenza e' estremamente esiguo o danneggiato da processi di degradazione, ha fatto di questo procedimento una delle scoperte piu' importanti nel campo della Biologia Molecolare.
LA REAZIONE
La PCR e' un metodo che permette di amplificare selettivamente in vitro, mediante una reazione a catena, sequenze stabilite di DNA o RNA di dimensioni fino a circa duemila paia di nucleotidi (basi), caratterizzandosi, quindi, per elevata specificita' anche nei casi in cui siano presenti molecole estranee a quelle d'interesse. L'amplificazione di RNA non e' possibile direttamente, ma puo' essere ottenuta se questo e' stato precedentemente trasformato in DNA complementare ( cDNA ) mediante una tappa iniziale di trascrizione inversa.
La PCR e' un processo ciclico caratterizzato da fasi condotte a diverse temperature, catalizzato da un enzima termostabile, nel corso del quale il numero di copie del DNA target ( DNA bersaglio ) raddoppia ad ogni ciclo, consentendo cosi' di ottenere, a partire anche da una sola catena di acido nucleico, una quantita' di copie pari a 2n , dove n corrisponde al numero di cicli effettuati; in questo modo, teoricamente, dopo 20 cicli, da una sola copia se ne sono formate 10 6 , dopo 30 cicli 10 7 , e cosi' di seguito.
Tale andamento esponenziale spiega la grande sensibilita' della PCR nella messa in evidenza di quantita' anche minime di DNA.
Questa metodica e' anche di semplice realizzazione, per il limitato numero di reagenti e di strumentazione richiesta, nonché di rapida esecuzione, potendo essere portata a termine generalmente in non piu' di 3 ore.
La reazione prevede la presenza di:
- DNA target
E' rappresentato da una molecola di DNA o RNA, o un frammento di questi di cui si vuole amplificare una determinata sequenza nucleotidica; serve da stampo per l'enzima DNA polimerasi.
Il DNA bersaglio, estratto dal materiale da esaminare, puo' essere lineare o circolare, mono o bicatenario, integro o degradato.
Le fasi di estrazione preliminare prevedono l'uso di enzimi proteolitici e di solventi organici, che rendano il DNA utilizzabile nell'esecuzione della reazione.
- Primers
Sono coppie di sequenze oligonucleotidiche ottenute per sintesi chimica, complementari a tratti del DNA target, cui si legheranno delimitando il segmento da amplificare, dettando quindi la specificita' della reazione.
Il primo ( forward primer ) funge da segnale di inizio per la polimerasi che leghera' il gruppo fosfato in posizione 5' del nucleotide all'ossidrile in posizione 3' del nucleotide del primer, allungandolo in direzione 3' > 5', mentre l'altro ( reverse primer ) agira' in direzione opposta completando il raddoppio di ogni singola catena del DNA target.
Ogni coppia di primers ha le sue concentrazioni e condizioni ottimali di reazione da determinare di volta in volta; infatti quantita' eccessive possono determinare inneschi in punti aspecifici del filamento di DNA che costituisce il target, inoltre un'alta percentuale di nucleotidi C o G nella sequenza del primer richiede temperature piu' elevate.
I primers dovrebbero essere costituiti da almeno 16 nucleotidi, preferibilmente non eccedere i 20 - 24, ed avere una sequenza che non incoraggi la formazione di dimeri stabili che diminuiscano o annullino la reazione a catena; la presenza di sequenze complementari nei due oligonucleotidi infatti, soprattutto all'estremita' 3', puo' comportare l'appaiamento di queste tra di loro.
- Desossiribonucleotidi
Questi sono i "mattoni" con i quali la polimerasi costruisce ex novo, partendo dal primer e scorrendo lungo il target, nuove sequenze nucleotidiche.
Nella miscela di reazione vanno aggiunti i 4 nucleotidi trifosfati ( dNTP ): Desossiadenintrifosfato ( dATP ), Desossicitosintrifosfato ( dCTP ), Desossiguanidintrifosfato ( dGTP ), Desossitimidintrifosfato ( dTTP ).
- DNA polimerasi
E' l'enzima che lega i nucleotidi complementari alla sequenza del filamento di DNA che funge da stampo, seguendo la direzione 5' > 3', partendo dall'estremita' 3' del primer.
La prima polimerasi impiegata da Mullis e coll. era ottenuta da Escherichia coli ( frammento di Klenow della DNA polimerasi I ), ma aveva l'inconveniente di essere termolabile e doveva percio' essere aggiunta ad ogni ciclo di amplificazione.
Attualmente viene utilizzata la polimerasi ricavata da un batterio termofilo, il Thermus aquaticus ( Taq DNA Polymerase ). Questa, a differenza dalla precedente, e' termostabile a 95°C, per cui non deve piu' essere aggiunta durante la reazione.
Oltre alla Taq DNA Polymerase sono oggi disponibili diverse DNA polimerasi termostabili estratte da altri microorganismi resistenti alle alte temperature, oppure delle varianti ottenute mediante ingegneria genetica.
- Soluzione tampone per PCR
E' costituita da KCl, Tris-HCl e MgCl2 in concentrazioni diverse in relazione al protocollo sperimentale.
Molto importante e' la concentrazione dello ione magnesio che va ottimizzata in relazione alla presenza di agenti chelanti ( EDTA ) e di ioni carichi negativamente.
FASI DELLA PCR
La PCR consiste in una ripetizione ciclica di tre fasi: denaturazione del DNA, appaiamento (annealing) dei primers ed estensione della sequenza.
Le diverse fasi di ogni ciclo richiedono diverse temperature, per la cui variazione e mantenimento negli intervalli di tempo stabiliti ci si avvale di apparecchi termici denominati "THERMALCYCLER", in grado di trasmettere calore ai supporti (provettine, micropiastre) contenenti la miscela di reazione.
Il significato di ogni fase e' il seguente. :
- DENATURAZIONE (94-95°C per 1'): apertura della doppia elica di DNA.
- ANNEALING (40-68°C per 1-2'): i primers si legano alle sequenze complementari del DNA bersaglio; la specificita' della reazione aumenta cosiderevolmente quando la temperatura scelta e' prossima a 60°C, piuttosto che a 40°C.
- ESTENSIONE (70-74°C per 1-2'):si attiva la Taq DNA polimerasi che provvede ad allungare la sequenza di DNA complementare al target, collocando al posto giusto i nucleotidi liberi presenti nella miscela di reazione.
Ogni ciclo viene generalmente ripetuto da 25 a 40 volte.
Dopo l'ultimo ciclo il campione e' generalmente incubato per 5-10' a 72°C per favorire al massimo la fase di estensione.
Al termine della reazione un'aliquota del campione viene analizzata mediante elettroforesi su gel di agarosio (1-3% in tampone TAE) contenente Bromuro di Etidio, un composto fluorescente fortemente mutageno in grado di inserirsi all'interno della struttura degli acidi nucleici.
La banda della dimensione attesa, corrispondente alla sequenza di DNA amplificata, viene visualizzata grazie ad un transilluminatore a raggi UV ed il gel puo' essere fotografato per mezzo di una camera fotografica provvista di apposito filtro arancione.
Cristina Rondini
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