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Numero 20 - giugno/luglio 2003
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Confronto di metodiche immunologiche e biomolecolari (PCR)
nella ricerca di S. aureus enterotossico in prodotti alimentari
F. Zuccon1, E. Bartocci2, S. Virgilio1, C. Rondini2, A. Firinu1, S. Scuota2
1- Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna - Sassari
2- Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche - Perugia
Staphylococcus aureus è responsabile di circa il 25% dei casi di intossicazioni alimentari. La dimostrazione della presenza di enterotossine nell'alimento viene effettuata comunemente mediante test immunologici, adatti anche per la ricerca di enterotossine prodotte in vitro.
In questo lavoro, parallelamente ai test immunologici, si sono ricercati mediante PCR i determinanti genetici di S. aureus che codificano per la produzione di tali enterotossine.
La caratterizzazione genotipica mediante PCR potrebbe rappresentare una tecnica rapida ed efficace, capace di rilevare il pericolo di potenziale enterotossinogenesi soprattutto durante le fasi del processo produttivo di un alimento.
INTRODUZIONE
La intossicazione stafilococcica è da attribuire generalmente ad una contaminazione dovuta ad una non corretta manipolazione dell'alimento da parte dell'uomo, nel quale vive come saprofita della cute e delle mucose; infatti molto spesso vengono isolati ceppi di S. aureus appartenenti al biotipo umano.
Sono stati individuate 5 principali enterotossine antigenicamente differenziabili, definite SEA, SEB, SEC (ulteriormente distinta nei tipi C1, C2 e C3) (2, 3), SED e SEE. L'enterotossina A è la più frequente (70% dei casi), seguita dai tipi D e B.
La diagnosi di laboratorio consiste nell'isolamento di stafilococchi coagulasi positivi dall'alimento contaminato e nella ricerca di enterotossina nell'alimento stesso o tra i prodotti esotossici elaborati dal batterio in vitro.
Attualmente vengono utilizzati kit diagnostici qualitativi e semiquantitativi; i primi sono basati su kit immunoenzimatici, gli altri utilizzano una reazione di agglutinazione inversa al lattice (RPLA).
Alle tecniche immunologiche si stanno affiancando tecniche alternative di diagnosi biomolecolare come la reazione a catena della polimerasi (PCR), che permette di individuare i determinanti genetici che presiedono alla sintesi delle enterotossine direttamente nei ceppi di S. aureus isolati (4, 5, 6, 7, 8).
In questo studio si è cercato di confrontare le metodiche sierologiche ELISA e RPLA con quelle biomolecolari.
MATERIALI E METODI
Matrici alimentari: Sono state esaminate 57 matrici alimentari positive per S. aureus, sulle quali è stata effettuata la ricerca di enterotossine attraverso prove immunologiche (ELISA e RPLA); i ceppi isolati da tali matrici sono stati saggiati attraverso le stesse prove immunologiche e attraverso prove biomolecolari (PCR) per ricercare i determinanti genetici codificanti per le enterotossine.
Ceppi batterici : sono stati utilizzati i seguenti ceppi di S. aureus: ATCC 13565 (SEA) , ATCC 14458 (SEB), ATCC 19059 (SEC), ATCC 23235 (SED), ATCC 27664 (SEE) e Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, quale controllo negativo.
Isolamento di Stafilococchi coagulasi positivi: è stato eseguito secondo la norma UNI 10984-2:2002 (1). La conferma di S. aureus è stata effettuata mediante prove biochimiche (DNAsi, mannitolo, VP)
Caratterizzazione fenotipica:
La ricerca delle enterotossine da alimenti e brodocolture è stata condotta mediante test ELISA (TECRA, Diessechem cod. BET 06) e test RPLA ( Oxoid, product code TD 900, England).
Caratterizzazione genotipica :
Estrazione del DNA target : per la rilevazione dei determinanti genetici che codificano per le 5 enterotossine, il DNA di ciascun ceppo è stato estratto mediante bollitura da colonie isolate, cresciute su agar sangue.
PCR: i primers per l'amplificazione di segmenti genici codificanti per le enterotossine sono descritti in Tabella 1;
E' stato utilizzato il seguente protocollo di amplificazione per tutte le coppie di primers:
Per rilevare la reazione di PCR, gli amplificati sono stati analizzati mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio al 2% contenente bromuro di etidio (0,5µg/ml) ad un voltaggio di 100V per circa 1 ora in TBE 1X (Trizma base, Acido Borico, EDTA 0.5M pH 8).
Al termine della corsa le bande sono state visualizzate con il transilluminatore a raggi UV (Fotodine 3-3102 Celbio).
| Tabella 1 : Sequenza dei primers per la rilevazione delle enterotossine stafilococciche |
| Gene |
Primer |
Sequenza nucleotidica (5'-3') |
Dimensioni dell'amplificato |
| SEA |
SEA-1
SEA-2
|
ttg gaa acg gtt aaa acg aa
gaa cct tcc cat caa aaa ca
|
120 bp |
| SEB |
SEB1-F2
SEB2-F2
|
gca gag agt caa cca gat cc
tgg tgc agg cat cat gtc
|
620 b |
| SEC |
SEC-1
SEC-2
|
gac ata aaa gct agg aat tt
aaa tcg gat taa cat tat cc
|
257 bp |
| SED |
SED-1
SED-2
|
cta gtt tgg taa tat ctc ct
taa tgc tat atc tta tag gg
|
317 bp |
| SEE |
SEE-1
SEE-2
|
tag ata aag tta aaa caa gc
taa ctt acc gtg gac cct tc
|
170 bp |
RISULTATI E CONCLUSIONI
La ricerca di enterotossina dagli alimenti è risultata negativa con entrambi i metodi immunologici impiegati.
Test ELISA: i ceppi di riferimento sono risultati tutti enterotossigeni; lo stesso andamento è stato osservato per alcuni ceppi coagulasi positivi isolati dagli alimenti.
Test RPLA: gli stessi stipiti di referenza analizzati si sono rivelati produttori delle corrispettive enterotossine, A , B, C e D; tra i ceppi di campo analizzati una percentuale non elevata è risultata in grado di produrre più di un tipo di enterotossina.
PCR: la prova biomolecolare ha fornito risultati incoraggianti, infatti per quanto riguarda i ceppi di riferimento sono state evidenziate mediante corsa elettroforetica le cinque bande di diverso peso molecolare, ognuna caratteristica del frammento genico amplificato (Fig. 1); alcuni ceppi in esame sono risultati positivi anche per più di un determinante genetico, confermando i dati ottenuti con il kit RPLA. Per quanto riguarda la prova di PCR eseguita su Staphylococcus epidermidis non è stata evidenziata alcuna banda, a dimostrare pertanto la specificità dei primers utilizzati (5).
Fig. 1 - Corsa elettroforetica per la rilevazione dei geni codificanti per le 5 enterotossine
| 1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
 |
Lane 1: SEA (120 bp), lane 2: negativo di reazione SEA (H2O), lane 3: SEB (620 bp), lane 4: negativo di reazione SEB (H2O), lane 5: SEC (257 BP), lane 6: negativo di reazione SEC (H2O), lane 7: SED (317 bp), lane 8: negativo di reazione SED(H2O), lane 9: SEE (170 bp), lane 10: negativo di reazione SEE (H2O), lane 11: Marker PCR.
I risultati ottenuti con il test ELISA ed il test RPLA (Tabella 2) dimostrano la attendibilità dei due metodi immunologici; confrontando inoltre i due tipi di caratterizzazione, fenotipica e genotipica, appare evidente una totale concordanza nei risultati, sia per i ceppi di riferimento che per i ceppi di campo; pertanto le metodiche adottate appaiono soddisfacenti.
La PCR ha il vantaggio esclusivo di rilevare tutti i ceppi potenzialmente enterotossigeni quindi può fornire risultati più esaurienti; in dettaglio dei 57 ceppi analizzati, provenienti da varie matrici alimentari, circa il 33% sono risultati enterotossigeni, con una prevalenza di circa il 26.3% per la SEA, il 15.7 % per la SEC , il 26.3 % per la SED, il 10.5% presenta l'associazione SEA-SED e SEB-SEC, lo stesso per SEB-SEC-SED, mentre non sono stati rilevati casi di positività per la enterotossina E.
Tabella 2: Tipizzazione fenotipica e genotipica dei campioni in esame
| Matrici analizzate |
Numero di campioni
(% ceppi enterotossigeni)
|
Tipizzazione fenotipica
ELISA RPLA
|
Tipizzazione genotipica
PCR
|
| Formaggi |
20
( 40.00%)
|
8 positivi |
4 SEA
1 SEA-SED
1 SEB- SEC
2 SEB-SEC-SED
|
4 SEA
1 SEA-SED
1 SEB- SEC
2 SEB-SEC-SED
|
| Latte |
13
(30.76% )
|
4 positivi |
1 SEB-SEC
3 SEC
|
1 SEB-SEC
3 SEC
|
Gelati, Preparazioni
gastronomiche |
15
(0.00% )
|
-- |
-- |
-- |
| Pasta alimentare |
9
(77.78%)
|
7 positivi |
1 SEA
5 SED,
1 SEA-SED
|
1 SEA
5 SED,
1 SEA-SED
|
DISCUSSIONE
Le tecniche immunologiche impiegate si dimostrano efficaci nell'individuare la tossina prodotta in vitro. Mediante PCR è possibile individuare i determinanti genetici che codificano per la produzione di enterotossine, indipendentemente dal fatto che tale produzione si verifichi oppure no.
La caratterizzazione genotipica indica pertanto il carattere di potenziale enterotossigenicità di S. aureus; la caratterizzazione fenotipica mediante metodi sierologici costituisce la prova certa della produzione di tossina da parte del batterio.
I metodi di caratterizzazione genotipica applicati alle matrici alimentari lungo la filiera produttiva, sono in grado di determinare la presenza di stafilococchi potenzialmente enterotossigeni in tempi molto brevi, permettendo interventi correttivi in corso d'opera per assicurare la produzione di un alimento salubre. La ricerca mediante PCR dei determinanti genetici che codificano per le enterotossine si dimostra quindi una metodica innovativa, rapida, efficace ed economica, nonché interessante dal punto di vista epidemiologico per lo studio dell'appartenenza dei ceppi enterotossici ai vari gruppi sierologici.
La futura applicazione di metodiche biomolecolari che prevedano l'estrazione del DNA batterico direttamente dalla matrice alimentare, consentirebbe di ridurre ulteriormente costi e tempi di risposta.
BIBLIOGRAFIA
1. Norma UNI 10984-2:2002. Metodo orizzontale di routine per la conta di stafilococchi coagulasi positivi.
2. Balaban N. and A. Rasooly. 2000. "Staphylococcal enterotoxins". International Journal of Food Microbiology. 61, 1-10.
3. Bokach, G.A., and P.M. Schlievert. 1987. "Nucleotide sequence of the staphylococcal enterotoxins C1 gene and relatedness to other pyrogenic toxins". Mol. Gen. Genet. 209, 15-20.
4. Johnson, W.M.S., S.D. Tyler, E.P. Ewan, F.E. Ashton, D.R. Pollard, and K.R. Rozee. 1991. "Detection of genes for enterotoxins, exfoliative toxins and toxic shock syndrome toxin 1 in Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction". J. Clin. Microbiol. 29, 426-430.
5. J. McLauchlin, G.L.Narayanan, V.Mithani and G. O'Neill. 2000. "The detection of enterotoxins and shock syndrome toxin genes in Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction". Journal of Food protection. 63, 479-488.
6. Schumacher-Perdreau F., Akatova A., Pulverer G. 1995. "Detection of staphylococcal enterotoxin B and toxic shock syndrome toxin: PCR versus conventional methods". Zentralbl Bakteriol. 282, 367-371.
7. Schmitz, F.J., M. Steiert, B. Hofmann, J.Verhoef, U. Hadding, H.P.Heinz, and Kohrer. 1998. "Development of a multiplex-PCR for detection of the genes for enterotoxin B and C, and toxic shock syndrome toxin-1 in Staphylococcus aureus isolates". J.Med. Microbiol. 47, 335-340.
8. Becker, K., R. Roth, and G.Peters. 1998. "Rapid and specific detection of toxigenic Staphylococcus aureus: use of two multiplex-PCR , enzyme immunoassays for amplification and hybridization of staphylococcal enterotoxin genes, exfoliative toxin genes, and toxic shock syndrome toxin 1 gene". J. Clin. Microbiol. 36, 2548-2553.
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