Webzine Sanità Pubblica Veterinaria

Numero 24 - maggio 2004 - http://spvet.it
Documento reperibile all'indirizzo:http://spvet.it/indice-spv.html#218

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Tracciabilità genetica nella filiera bovina:
Short Tandem Repeats (STR) per la verifica del sistema di etichettatura.



Papa Paola1, Biagetti Massimo1, Sebastiani Carla1, Laudisio Paolo2, Ghiandoni Stefano3, Pezzotti Giovanni1, Foglini Angelo1


(1) Istituto Zooprofilatico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche Via G. Salvemini, 1 Perugia
(2) Bovinmarche Via Achille Grandi, 48E Ancona
(3) Molini Popolari Riuniti Piazza della Solidarietà, 2-3-1 Ellera di Corciano - Perugia




Introduzione
In risposta alla crisi di fiducia dei consumatori e alla loro diffidenza nei confronti della gestione della filiera produttiva della carne bovina, in seguito all'emergenza BSE e nel quadro degli sforzi attualmente in atto per migliorare e rendere più sicuri i prodotti alimentari, il Parlamento Europeo ha emanato il Regolamento CE 1760/2000 riguardante il sistema d'etichettatura delle carni bovine e dei prodotti a base di carne. Per gli operatori e le organizzazioni che commercializzano carni bovine nella Comunità, tale Regolamento, con le sue successive modifiche, istituisce un sistema obbligatorio di etichettatura "tale da evidenziare il nesso fra, da un lato, l'identificazione della carcassa, del quarto e dei tagli di carne, dall'altro, il singolo animale oppure il gruppo di animali di cui trattasi, ove ciò sia sufficiente a consentire di verificare informazioni che figurano sull'etichetta (art. 13 Reg. CE 1760/2000)".

Il sistema di identificazione e di registrazione dei bovini si applica utilizzando marche auricolari e passaporti che accompagnano l'animale; risulta evidente, pertanto, che la veridicità delle informazioni fornite dal sistema di identificazione ed etichettatura non possa essere verificata in altro modo che controllando la documentazione cartacea e/o elettronica.

Nonostante la buona fede e volontà degli operatori, tali flussi informativi possono essere soggetti a modifiche od errori.
Pertanto, è risultato indispensabile trovare uno strumento che affiancasse i sistemi di rintracciabilità in atto in modo che ciascuno degli operatori della filiera, fino al consumatore finale, possa accertare con sicurezza l'origine della carne; tale strumento è l'analisi del DNA.

Alcune zone altamente variabili del genoma, i microsatelliti o STR (Short Tandem Repeats), sono sequenze di DNA costituite da un numero variabile di corte ripetizioni di nucleotidi (di solito dinucleotidi come [CA]n); questi polimorfismi conferiscono agli individui una grande variabilià genetica.

Studiando ed analizzando più polimorfismi si produce un profilo genetico caratteristico di ogni individuo ("DNA Fingerprint"), cioè un'impronta digitale che si basa sulla sequenza del DNA (Figura 1).



Per assicurare che ogni individuo sia caratterizzato in maniera univoca, statisticamente valida, queste regioni (loci) devono essere analizzate in un numero sufficiente.
Gli obiettivi di questo lavoro sono stati molteplici: dall'individuazione di un idoneo set di loci microsatelliti all'applicazione del DNA fingerprinting alle razze bovine più comunemente commercializzate partendo da diverse tipologie di matrice (carni fresche, congelate e cotte).
Il progetto "Tracciabilità genetica della filiera bovina" è nato dalla collaborazione dell'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche con due realtà produttive e distributive locali di carni bovine (Bovinmarche e Molini Popolari Riuniti). Sono stati prelevati al mattatoio dei campioni di sangue bovino (campioni di riferimento) e, successivamente, nelle macellerie affiliate, sono stati prelevati i campioni di carne che dovevano appartenere agli stessi animali (campioni di verifica).

I campioni di sangue e carne sono stati prelevati da bovini appartenenti a razze bovine autoctone e non, allo scopo di verificare l'applicabilità del metodo STR su campioni di tutte le razze da carne comunemente macellate e vendute.
Nel periodo tra giugno 2002 e giugno 2003 è stata costituita una banca genomica rappresentativa di 850 campioni comprensivi di 471 campioni di sangue e 415 campioni di carne (Figura 2).



Per valutare tutte le possibili applicazioni dell'analisi degli STR, sono stati esaminati campioni di muscolo appena macellato, carni a differenti stadi di frollatura e carni cotte con diverse modalità: bollitura in acqua, grigliatura su piastra e cottura al forno microonde alla massima potenza.
Inoltre sono stati allestiti in laboratorio dei campioni di carne lavorata aggiungendo alla carne, spezie (sale e pepe), uovo e parmigiano al fine di verificare eventuali problemi analitici dovuti ad inibizione della reazione di PCR (da parte delle spezie) o ad aspecificità data dalla presenza di DNA omologo (parmigiano) ed eterologo (uovo).
Da tutte le tipologie di matrici è stato estratto il DNA mediante il metodo fenolo-cloroformio. Sui campioni di DNA è stata effettuata una Reazione a Catena della Polimerasi (PCR) in multiplex, che ha permesso di amplificare contemporaneamente 11 loci microsatelliti (Kit StockmarksÒ-Applied Biosystems).

Successivamente, i prodotti della reazione di PCR sono stati separati ed evidenziati mediante elettroforesi capillare impiegando lo strumento Abi Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) ed elaborando i dati ottenuti con il software fornito dalla stessa ditta.

Una volta ottenuti gli elettroferogrammi dei campioni analizzati, i profili del DNA del campione di verifica e di quello del corrispondente campione di riferimento sono stati messi a confronto. I risultati sono evidenziati nella seguente tabella:



Sono stati considerati identici (quindi appartenenti allo stesso animale) i campioni i cui profili genetici si sono presentati perfettamente sovrapponibili in tutti gli undici loci analizzati (Figura 3).



Qualora due profili risultino sovrapponibili, l'identità è certa con un certo grado di probabilità ("degree of confidence") dipendente dalle frequenze alleliche dei loci analizzati in una data popolazione.
Mediante un calcolo statistico è stato possibile affermare che, utilizzando questi 11 microsatelliti sulla popolazione bovina locale il "degree of confidence" è molto alto: esiste infatti solo una probabilità su 10 miliardi che due campioni provenienti da differenti individui presentino lo stesso profilo allelico.
D'altro canto si può affermare con una attendibilità del 100%, che due campioni non appartengono allo stesso individuo (Non identità) qualora i profili differiscano anche per un solo locus (Figura 4).



Dalle analisi effettuate si può affermare che il set di 11 microsatelliti utilizzati si è rilevato discriminante per tutti i soggetti appartenenti alle razze testate e permette di distinguere con sicurezza 2 individui diversi.
Gli undici microsatelliti analizzati sono risultati efficaci nella distinzione degli individui delle razze considerate; su un totale di 425 analisi di confronto genetico sono stati riscontrati 5 casi di non identità.

Tali risultati hanno costituito lo spunto per le aziende distributrici coinvolte nel progetto, ad effettuare un'analisi delle cause possibili di "malfunzionamento" del sistema di etichettatura e ad applicare idonee azioni correttive. Le indagini effettuate in seguito al riscontro di "non identità", hanno ricondotto in tutti i casi a non conformità del sistema cartaceo di gestione della tracciabilità.
Inoltre, il DNA estratto da tutte le matrici prese in considerazione (sangue, carne fresca, congelata, frollata, cotta, lavorata) ha dato risultati di amplificazione soddisfacenti, dimostrando che la frollatura, la cottura e la lavorazione delle carni non pregiudicano la possibilità di effettuare una prova di tracciabilità genetica.
Questo risultato dimostra, inoltre, come l'applicabilità della metodica per il controllo della tracciabilità delle carni bovine sia anche estensibile ai centri di preparazione pasti ed alla ristorazione collettiva in genere.

In conclusione, i dati ottenuti dimostrano che l'utilizzo di metodiche analitiche biomolecolari (Short Tandem Repeats) si presta ad essere uno strumento di controllo affidabile per la verifica del sistema di tracciabilità in ogni fase della filiera produttiva, con possibili vantaggi per tutte le figure coinvolte nella produzione, commercializzazione, distribuzione, somministrazione e controllo delle carni bovine.
Infine, la tecnica analitica descritta, offre la possibilità di ulteriori potenziale applicazioni, non strettamente collegate al controllo delle carni, ma anche alla tracciabilità degli animali, la loro identificazione, e, più in generale, alle gestione e controllo delle problematiche di sanità pubblica veterinaria nel settore bovino.

Bibliografia
Balding D.J., Nichols R.A., 1995. "A method for quantifying differentiation between populations at multi-allelic loci and its implications for investigating identity and paternity". Genetica, 96:3.

Ciampolini R., Moazami-Goudarzi K, Vaiman D, Dillmann C, Mazzanti E, Foulley JL, Leveziel H, Cianci D. 1995 "Individual multilocus genotypes using microsatellite polymorphisms to permit the analysis of the genetic variability whitin and between italian beef cattle breeds". J. Anim. Sci., 73: 3259.

Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H., 1986."Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction". Cold Spring Harb Symp Quant Biol.;51 Pt 1:263.

Sancristobal-Gaudy M., G. Renand, Y. Amigues, M.-Y. Boscher, H. Levéziel, B. Bibe. 2000. "Tracabilitè individuelle des viandes bovines à l'aide de marqueurs génétiques". INRA Prod. Anim., 13 (4): 269.

Vaiman D., Mercier D, Moazami-Goudarzi K, Eggen A, Ciampolini R, Lépingle A, Velmala R, Kaukinen J, Varvio SL, Martin P, Levéziel H., Guérin G., 1994 (a)."A set of 99 cattle microsatellites: characterization, synteny mapping, and polymorphism". Mammalian Genome, 5: 288.

Witensbor H., Vogel J., Michelmore R.W., 1997. "Identification, genetic localizationand allelic diversity of selectively amplified microsatellite polymorphic loci in lettuce an wild relatives (Lactuca spp.)". Genome, 40: 923.

Legislazione di riferimento
Reg.(CE) 1760/2000 della Commissione del 17 luglio 2000 pubblicato su G.U.CE L. 240 del 11/08/2000 "Sistema di identificazione e di registrazione dei bovini e relativo all'etichettatura delle carni bovine e dei prodotti a base di carni bovine, e che abroga il Regolamento (CE) n. 820/97 del Consiglio.

Reg.(CE) 1825/2000 della Commissione del 25 agosto 2000 pubblicato su G.U.CE L. 216/8 del 26/08/2000 recante modalità di applicazione del regolamento (CE) n. 1760/2000 del Parlamento europeo e del Consiglio per quanto riguarda l'etichettatura delle carni bovine e dei prodotti a base di carni bovine.

D.M. n° 22601 del 30 agosto 2000 del Ministero per le Politiche Agricole pubblicato su G.U.R.I. n. 268 del 16/11/2000 concernente: Indicazioni e modalità applicative del regolamento (CE) n. 1760/2000 sull'etichettatura obbligatoria e su quella facoltativa delle carni bovine e dei prodotti a base di carni bovine.
Con questa circolare molti dei dubbi interpretativi di norme precedenti dovrebbero essere sufficientemente chiariti.
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