Webzine Sanità Pubblica Veterinaria
Numero 25 - giugno 2004 - http://spvet.it
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LA DIAGNOSTICA DELLE SALMONELLOSI ALIMENTARI:
A CHE PUNTO SIAMO?
Telemaco Cenci
[relazione presentata nel corso della XIII Conferenza Nazionale "La Sicurezza microbiologica nella produzione di alimenti per il 21° secolo - Aggiornamenti sui principali patogeni enterici nella filiera alimentare: Salmonella, Campylobacter, E. coli patogeni, virus" - 11 Maggio 2004 Palazzo della Cultura e dei Congressi - Bologna Fiera]
INTRODUZIONE
Le salmonelle sono i batteri più frequentemente identificati nel mondo come agenti di malattia trasmessa con gli alimenti. Possono essere ospitate e/o colonizzare l'intestino di uccelli, rettili e mammiferi e si possono trasmettere all'uomo attraverso una svariata quantità di prodotti alimentari, specialmente quelli di origine animale. Sono in grado di provocare una tipica tossinfezione, legata alla presenza di germi nell'alimento e non alle loro tossine in esso preformate.
La Salmonellosi si manifesta con sintomi comuni a molte altre gastroenteriti (nausea, vomito e diarrea), con crampi addominali e febbre.
Può evolvere in modo più severo in soggetti in giovanissima età, debilitati o immunocompromessi. Si ritiene che, affinché si verifichi un episodio tossinfettivo, sia necessaria l'ingestione di un numero di salmonelle relativamente elevato, almeno superiore a 105.
La dose infettante è comunque dipendente da vari fattori legati all'ospite (età, stato di salute, velocità di transito dell'alimento nel lume intestinale, ecc), alla composizione chimica dell'alimento, alla virulenza del ceppo. L'ingestione di salmonelle in numero basso, tale da non provocare malattia, potrebbe indurre lo stato di "portatore sano", per cui il soggetto diverrebbe eliminatore di germi per un certo periodo di tempo.
Il serbatoio principale di salmonelle è costituito dall'intestino umano ed animale, dove tali germi possono condurre una vita da "saprofiti".
La contaminazione degli alimenti si può verificare in qualsiasi punto del percorso che va dalla produzione alla tavola. La contaminazione può essere "primaria": per le carni si verifica generalmente nella fase di eviscerazione; nel caso delle uova durante il transito in cloaca; negli organismi filtratori è determinata dalla concentrazione del batterio inquinante il loro habitat idrosalino; per frutta e verdura dalla irrigazione/fertirrigazione con liquidi contaminati.
La contaminazione "secondaria" si verifica invece durante i processi di produzione e/o preparazione dell'alimento per contaminazione crociata tra materie prime contaminate e non contaminate e tra alimenti crudi e cotti o anche da parte degli operatori dell'industria alimentare portatori di salmonelle.
La prevenzione inizia con piani di sorveglianza a livello di allevamento, con l'obiettivo di ridurre il numero di portatori sani: l'eliminazione risulta attualmente obiettivo irraggiungibile per alcune specie animali, specialmente avicole e suina.
Pertanto, la contaminazione con materiale intestinale, per quanto limitata (Decisione 471/2001 CE), resterà sempre possibile.
Considerato che per dare luogo alla malattia, il numero di Salmonelle ingerite da un soggetto in buono stato di salute deve essere piuttosto cospicuo, diventa cruciale impedire lo sviluppo del batterio sull'alimento contaminato.
E' pertanto della massima importanza, ai fini della prevenzione della Salmonellosi umana, il contenimento del numero di salmonelle sull'alimento e, per gli alimenti "freschi", l'integrità della catena del freddo. (Una temperatura inferiore a +5,2 °C blocca la moltiplicazione di Salmonella).
PRESENZA DI SALMONELLA NEGLI ALIMENTI
Gli alimenti più frequentemente incriminati nei casi di tossinfezione sono nell'ordine: le carni avicole, quelle suine ed i loro derivati, le uova, pesci e molluschi, i prodotti vegetali.
Ciò è confermato dai dati sulla contaminazione da Salmonella negli alimenti di origine animale in Italia, pubblicati nel novembre 2003 dal gruppo di lavoro per l'Epidemiologia Veterinaria (GLEV).
Nel corso del biennio 2001-2002 sono stati esaminati, nell'ambito dell'attività degli Istituti Zooprofilattici Sperimentali, 76.000 campioni di alimenti di origine animale (prelevati in varie fasi di produzione, alla vendita e alla somministrazione) per ricerca di Salmonella: il 2,3% è risultato positivo.
La prevalenza era 4,8% per i prodotti carnei, 2,7% per uova ed ovoprodotti, 0,5% per pesci,crostacei e molluschi e 0,2% per i prodotti lattiero/caseari. Nell'ambito dei prodotti carnei la prevalenza più elevata è stata riscontrata nel pollame (8,8%) e nelle carni suine (4,9%).
I sierotipi isolati più di frequente erano S. Typhimurium (19%), S. Derby (12%), S. Enteritidis (8%), S. Infantis (5%) e S. Blockley (5%).
Questi cinque sierotipi corrispondevano ai cinque sierotipi isolati più frequentemente da casi umani nello stesso periodo. La prevalenza di Salmonella riscontrata dal GLEV non si discosta dai dati proposti da altri Paesi dell'U.E.
I dati del Piano Triennale Alimenti della Regione dell'Umbria, relativi agli anni 2001-2002-2003, evidenziano una prevalenza di Salmonella, ancora più marcata, nei prodotti carnei (5,6% per carni macinate e preparazioni di carne; 4,5% per carni fresche; 3,9% per prodotti a base di carne).
DATI EPIDEMIOLOGICI
Negli Stati Uniti, secondo i CDC (Centers Disease Control), sono circa 40.000 i casi di Salmonellosi riportati ogni anno dal sistema di sorveglianza, un numero sicuramente sottostimato per la bassa tendenza a rivolgersi al servizio sanitario da parte di chi ha contratto l'infezione.
I CDC stimano che il numero reale dei casi possa essere di almeno trenta volte più alto.
Dal 1996 al 2003 l'incidenza della Salmonella negli U.S.A. è rimasta invariata, mentre quella degli altri agenti di malattie da alimenti si è ridotta considerevolmente.
I bambini (1-5 anni) sono i soggetti più colpiti dalla Salmonellosi, e assieme ad anziani e a soggetti immuno-compromessi, sono anche quelli nei quali l'infezione risulta essere più grave. Sarebbero almeno 600 le persone che ogni anno muoiono negli Stati Uniti dopo aver contratto una Salmonellosi acuta.
In Italia, in base ai dati forniti dal WHO surveillance Programme for Control of Foodborne Infections and Intoxication in Europe 8h Report 1999-2000 Country Report: ITALY (grafico 2), dai 20.000 casi notificati nel 1993, siamo scesi agli 11.500 del 2000.
Il sistema ENTER-NET Italia nel biennio 2001-2002 ha rilevato in S. Typhimurium il ceppo più frequentemente isolato dall'uomo (46,8%), seguito da S. Enteritidis (26,6%).
Nel triennio 2000-2002, i casi umani sostenuti da S. Enteritidis sono passati dal 45%, percentuale costantemente osservata negli anni '90, al 20%.
Tali dati potrebbero essere legati alle misure di profilassi (vuoto sanitario) attuate negli allevamenti avicoli a seguito della epidemia di Pseudopeste.
Nel 2003 (grafico 3), infatti, si nota una netta risalita di S. enteridis rispetto al biennio 2001-2002 (35.8% S. enteridis e 37.7% S. typhimurium).
SALMONELLA NELLE CARNI
I dati sopra riportati mettono in evidenza l'importanza rivestita dai prodotti carnei nella diffusione di Salmonella.
Ma quali sono le fasi più delicate della filiera produttiva e dei vari processi di fabbricazione in cui la Salmonella può moltiplicarsi?
È già stata ricordata la difficoltà di eradicazione dei portatori sani in allevamento; va posta pertanto particolare attenzione alle fasi di macellazione, di eviscerazione e di sezionamento, durante le quali si verifica la contaminazione delle carcasse e quindi dei successivi tagli di carne.
La catena del freddo e l'igiene delle attrezzature (residui di carne nei tritacarne, impastatrici ed insaccatrici possono perpetuare l'inquinamento delle produzioni) risultano essenziali per ostacolare la moltiplicazione del germe.
Nel corso della commercializzazione, le temperature di conservazione dovrebbero essere le più basse possibili (tra +1°C e +4°C), in modo da evitare che le eventuali salmonelle presenti abbiano la possibilità di moltiplicare per raggiungere quei valori indispensabili per l'insorgenza della tossinfezione.
La sopravvivenza di Salmonella nelle carni salate e negli insaccati può superare mediamente i due mesi; il periodo di permanenza è influenzato da numerosi fattori legati alla tecnologia di produzione (aw, pH, potenziale di ossido-riduzione, competizione con i microrganismi delle colture starter, temperatura ecc.), ma il più importante è sicuramente costituito dalla dose di contaminazione.
La distribuzione delle salmonelle nel prodotto in esame non è uniforme, e pertanto la pratica del campionamento (anche la formazione del campione da sottoporre ad analisi in laboratorio) riveste notevole importanza. In determinati prodotti (carni macinate e preparazioni di carne) la normativa vigente (D.P.R. 309/1998) prevede che la ricerca di salmonelle vada sempre effettuata in cinque unità campionarie.
DIAGNOSI DI LABORATORIO
Il controllo e la prevenzione delle Salmonellosi si basa essenzialmente sulla puntuale diagnostica di laboratorio.
La rapida determinazione dell'agente patogeno è oggi più che mai un'esigenza dei produttori di alimenti ed anche degli organi di controllo, i quali, dovendo garantire la sicurezza alimentare anche di alimenti deperibili, richiedono risultati conformi al vero in tempi brevi.
La crescente disponibilità di metodi rapidi commerciali, con interessanti caratteristiche di specificità e sensibilità, ha favorito l'applicazione degli stessi anche in contesti diversi dall'ambiente produttivo, ad esempio nei laboratori di analisi pubblici e privati non direttamente coinvolti nel controllo di produzione.
METODI RAPIDI.
Definire correttamente un "metodo rapido" ed effettuarne una classificazione esaustiva è compito arduo.
Qual è l'entità di accelerazione nell'esecuzione e nel fornire la risposta in tempi brevi perché una metodica di laboratorio possa essere definita rapida? La validità di un metodo rapido in alternativa all'approccio tradizionale è condizionata da molteplici fattori:
a. validazione o riconoscimento a livello internazionale come metodo per l'accertamento della salubrità del prodotto;
b. precisione ed accuratezza;
c. capacità di generare rapidamente risposte attendibili in relazione alla sicurezza del prodotto alimentare;
d. economicità;
e. nel caso dei metodi strumentali, disponibilità di una idonea rete di assistenza tecnica.
I metodi rapidi rappresentano un capitolo della microbiologia alimentare in continua espansione.
Cercheremo di proporre una panoramica, anche parziale, dei metodi rapidi che hanno registrato il successo applicativo maggiore in laboratori interni all'industria alimentare, limitandoci pertanto a descrivere solo alcune metodiche basate sulla determinazione di macromolecole cellulari, direttamente correlate alla presenza dei microrganismi: metodi immunologici (ELISA, EIA, ELFA) e metodi fondati su tecnologie genetiche, tutti basati sulla tecnica PCR (metodiche di amplificazione di sequenze anonime quali AFLP, AP-PCR, DAF, RAPD e metodiche di amplificazione selettiva di sequenze specifiche quali rep-PCR, eric-PCR, tDNA-PCR, ARDRA, ITS, sequenziamento del 16S rDNA).
Progettati per il controllo in linea, i metodi cosiddetti rapidi sono oggi spesso utilizzati, come screening, anche da laboratori di prova pubblici e privati, per effettuare analisi sia in regime di autocontrollo che su "campioni ufficiali".
Tutti i metodi di screening per la determinazione di batteri patogeni necessitano di una o più fasi di arricchimento e si propongono come determinazioni qualitative (presenza/assenza del patogeno in x grammi di campione).
Inoltre, non sono in grado di discriminare tra cellule batteriche vive e non; pertanto i campioni risultati positivi debbono essere confermati con metodi colturali.
ELISA, EIA, ELFA
Una tecnica comunemente usata per la determinazione di antigeni batterici da alimenti è conosciuta come "ELISA sandwich", dove un quantitativo rilevante di anticorpo è adsorbito ad una superficie solida (un pozzetto di una piastra microtiter, un dipstik, un puntale ecc.); viene aggiunto il campione e se l'antigene è presente, quest'ultimo si lega all'anticorpo; viene successivamente aggiunto un anticorpo legato ad un enzima che a sua volta si lega all'antigene formando un complesso: anticorpo adsorbito-antigene-anticorpo legato all'enzima.
A questo punto viene aggiunto un substrato che può essere o colorimetrico o fluorogenico; la presenza dell'enzima corrispettivo legato darà luogo allo sviluppo di un composto colorato o fluorescente, la cui intensità, proporzionale alla quantità di antigene presente nel campione, potrà essere misurata attraverso apposito lettore.
L'applicazione di tale metodo ad attività analitiche di routine può essere agevolata dalla disponibilità di sistemi automatici, quali il Vidas (ELFA) e l'EIA-Foss.
Quintavalla e coll. (1996), confrontando questi due metodi automatici con il metodo ISO per Salmonella in matrici carnee, hanno osservato accordo con il metodo ISO nel 96,04% dei campioni per il Vidas e nell'80,2% dei campioni per l'EIA-Foss; entrambi i metodi automatici sono risultati più rapidi e semplici ed altrettanto sensibili rispetto al metodo ISO, ma il Vidas ha dimostrato una incidenza nettamente inferiore di falsi positivi.
Sarais e coll. (1994), utilizzando Vidas per la determinazione di Salmonella nelle carni avicole, hanno osservato una incidenza di falsi positivi pari al 6% e di falsi negativi pari al 2%.
PCR (Polymerase Chain Reaction) e tecniche derivate
L'applicazione di tecniche di amplificazione molecolare basate sulla reazione PCR si è rivelata essere un mezzo estremamente veloce ed efficace per l'identificazione, la tipizzazione ed il monitoraggio dei batteri ed ha aperto nuove interessanti prospettive per un proficuo impiego dei metodi di ibridazione nel controllo degli alimenti.
Le varie tecniche, che differiscono oltre che per l'approccio operativo, anche per la loro specificità, generano un fingerprinting molecolare che assume le sembianze di un codice a barre, il numero delle quali dipende dal tipo di tecnica utilizzata.
L' identificazione di un isolato batterico ignoto avviene mediante confronto con il codice a barre ottenuto con uno o più ceppi tipo.
In generale questi metodi possono esse suddivisi in due classi, la prima delle quali comprende quei metodi (rep-PCR, eric-PCR, tDNA-PCR, ARDRA, ITS, sequenziamento del 16S rDNA) che prevedono la conoscenza almeno della sequenza di appaiamento dei due primer; la seconda include quelle metodologie (AFLP, AP-PCR, DAF, RAPD) che permettono di amplificare uno o più frammenti di DNA anonimi, senza che sia necessaria una previa conoscenza delle sequenze bersaglio.
L'amplificazione del materiale genetico della reazione conferisce a questo metodo caratteristiche importanti di sensibilità e anche di specificità di estremo interesse; tuttavia, la notevole sensibilità può rappresentare anche uno svantaggio, perché la contaminazione crociata con DNA estraneo può determinare rumori di fondo che alterano la risposta.
La procedura PCR permette di determinare, entro 24 ore (16-20 ore fase di prearricchimento), con elevata specificità, la presenza di quantità minime di patogeni presenti nel campione; la sensibilità del metodo è stimata in 1UFC/25 g alimento.
Il tempo di risposta del metodo PCR può essere ridotto applicando preventivamente la separazione immunomagnetica, che migliora il recupero dei microorganismi dal campione e riduce le interferenze legate alla composizione dei terreni di prearricchimento.
Molte metodiche molecolari sono state sperimentate in campo alimentare ed applicate per la messa in evidenza delle salmonelle nelle più svariate preparazioni alimentari: alcune per monitorare l'eventuale presenza del batterio in un campione (RAPD), altre per caratterizzare l'isolato (ERIC, REP).
Fra i sistemi, basati sulla tecnologia PCR, che si sono maggiormente affermati sul mercato vanno ricordati il BAX ed il Riboprinter, entrambi della DuPont Qualicon.
Il BAX® viene utilizzato per lo screening di Salmonella su materie prime e su alimenti finiti. E' necessario un prearricchimento ed il tempo di risposta è di 30 ore circa.
Tale sistema è stato riconosciuto dall'AOAC Official Methods per l'identificazione di Salmonella.
Il sistema di ribotipizzazione RiboPrinter utilizza dei frammenti di acidi nucleici da genoma batterico derivati dall'azione di un enzima di restrizione.
Si tratta di uno strumento completamente integrato che produce impronte genetiche caratteristiche di ogni isolato batterico e permette di identificare e caratterizzare il patogeno alimentare, discriminando non solo generi e specie, ma anche i singoli ceppi.
ESPERIENZE IZS UM (Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche)
L'IZS UM ha adottato la metodica ELFA (VIDAS), effettuando una validazione interna, accreditandola SINAL per i risultati negativi, confermando invece i positivi con la metodica tradizionale (ISO 6579:2002).
Il laboratorio di Microbiologia degli Alimenti dell'IZS di Perugia utilizza questa procedura dal 1998 per la ricerca di Salmonella spp.
Per quanto riguarda la valutazione del sistema VIDAS Salmonella, sono stati saggiati 500 campioni di alimenti, per confronto con il metodo tradizionale.
Sono stati riscontrati valori concordanti fra i due metodi nel 96,20% dei casi; la metodica VIDAS ha dato luogo ad un falso negativo (0,20%) e a 18 falsi positivi (3,60%).
Il riscontro di falsi positivi può essere imputato a:
- maggiore sensibilità rispetto al metodo tradizionale, che, lavorando su base immunoenzimatica, riesce a svelare il patogeno anche a livelli di contaminazione molto bassi. La sensibilità del metodo di isolamento in uso nel nostro laboratorio è stata stimata in 20 UFC/g per Salmonella spp.
- possibilità di reazioni crociate con altri microrganismi che presentano analogie dal punto di vista antigenico con l'analita ricercato
- rilevamento di cellule morte, stressate o comunque non vitali che, pur essendo presenti nell'alimento, non sono in grado di moltiplicarsi e quindi non sono evidenziabili con le tecniche di isolamento.
L'elemento che rende il sistema VIDAS o altro sistema di screening adatto alle esigenze di un laboratorio preposto al controllo ufficiale degli alimenti è costituito dal fatto che la maggior parte dei campioni risulta negativa e pertanto un sistema che dà la certezza del negativo in tempi brevi, semplifica le attività analitiche.
Altri vantaggi sono: la rapidità di esecuzione, l'automazione del metodo che richiede una manualità minima, la standardizzazione del metodo che consente una interpretazione obiettiva indipendente dall'operatore.
Nei controlli ufficiali tuttavia è necessario confermare il risultato mediante isolamento della Salmonella, che permetta di dimostrare che il germe in questione è vitale e capace di moltiplicarsi nell'alimento, dato che il suo riscontro comporta denuncia all'autorità giudiziaria.
METODICA TRADIZIONALE
Isolamento e identificazione
Le procedure standard per la ricerca di Salmonella dagli alimenti richiedono l'isolamento del batterio e l'allestimento di colture pure seguito da prove che analizzano alcune caratteristiche fenotipiche, quali i caratteri morfologici e biochimici.
L'isolamento, mediante coltura, è il metodo ufficiale di riferimento per la ricerca di Salmonella dagli alimenti (metodica ISO 6579:2002); è sicuramente il metodo più attendibile e specifico, ma richiede tempi piuttosto lunghi, almeno 4-5 giorni.
Tipizzazione
La successiva tipizzazione sierologica e fagica e la subtipizzazione molecolare è essenziale per rispondere alla domanda: come essere certi che la salmonella isolata dall'alimento è la vera causa di quella tossinfezione?
I metodi universalmente accettati per la tipizzazione delle salmonelle sono rappresentati dalla sierotipizzazione e dalla fagotipizzazione in grado di discriminare all'interno dei sierotipi.
ULTERIORE CARATTERIZZAZIONE DEI CEPPI ISOLATI
Attualmente, per approfondire il ruolo patogeno ed epidemiologico dei ceppi isolati, non ci si ferma alla sierotipizzazione, né alla tipizzazione fagica, ma si ricorre a quella molecolare, mediante l'individuazione dei profili ribosomiali e del DNA cromosomiale e al numero e peso molecolare dei plasmidi.
Si è potuto così costatare che, nell'ambito del sierotipo, la virulenza e la capacità di persistenza e diffusione dell'infezione sono direttamente collegate a determinati fagotipi e profili genetici.
Ai fini epidemiologici ci si è accorti che il sierotipo, considerato isolatamente, può condurre a conclusioni errate, in particolare quando si tratta di valutare la "nocività" di un ceppo di salmonella.
Infatti, lo studio dei profili plasmidici e ribosomiali e le prove d'ibridizzazione del genoma hanno messo in evidenza che il sierotipo è costituito in realtà da una popolazione di elementi batterici molto variabili, relativamente alla capacità di dare infezione localizzata o sistemica, malattia primaria o secondaria, di essere lisato dai fagi e alla specificità per l'ospite.
Questi caratteri in un ceppo di salmonella potranno rimanere stabili per un periodo più o meno lungo, ma finiranno inevitabilmente per cambiare. I plasmidi, compresi quelli di virulenza, presenti in tutte le salmonelle a patogenicità specifica e largamente riscontrati anche nelle S. enteritidis, S. typhimurium, S. heidelberg e in molte altre, possono passare facilmente da un ceppo ad un altro, cambiarne le caratteristiche e anche il fagotipo.
Un ceppo di salmonella, identificato con prove biochimiche e sierologiche, può essere ulteriormente tipizzato come sierotipo, fagotipo (lisotipo) e per la resistenza agli antibiotici (resistotipi).
Le moderne biotecnologie mettono a disposizione diversi metodi di tipizzazione molecolare, utilizzati non tanto per la diagnostica, quanto per la ricerca e per gli studi epidemiologici.
Uno dei più utilizzati è quello che va sotto il nome di Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) o elettroforesi in campo elettrico pulsato, in cui i frammenti di DNA di grossa taglia, ottenuti con endonucleasi aventi siti di restrizione infrequenti, vengono separati con elettroforesi, in campi pulsanti, per individuare i pulsotipi.
La PFGE è altamente discriminante e capace di suddividere gli isolati batterici correlati a situazioni epidemiologiche. Il confronto dei profili elettroforetici di ceppi di focolai epidemici di Salmonellosi, insieme ad altri dati di tipizzazione e alle informazioni epidemiologiche, diventa una solida base di partenza per l'introduzione di appropriate strategie di intervento.
La bibliografia è disponibile presso l'autore t.cenci@pg.izs.it - 075-3431
