Webzine Sanità Pubblica Veterinaria

Numero 27 - dicembre 2004 - http://www.izsum.it/webzine.html

torna indietro


DIFFUSIONE NELLA REGIONE MARCHE DI UNO STIPITE EMERGENTE DI SALMONELLA MONOFASICA SIEROTIPO [4,5,12:I:-]


di M. Staffolani, G. Striano, E. Micci, G. Perugini e S. Fisichella


SUMMARY
In this study 72 strains of the emerging new serotype of Salmonella enterica [4,5,12:I:-] collected by Enteropathogenic Bacteria Regional Reference Laboratory between 2003-2004 were analysed. Most of these strains were of human origin and were analyzed to determin phage types and antimicrobial resistance profiles. The aim of this study is to establish the spread and the incidence of this new serotype in Marche region. We report that, as in Italy, this multiresistant Salmonella serotype [4,5,12:I:-] rapidly emerged in Marche region during 2003 and 2004.

Introduzione
Nel corso del 1997 il Laboratorio di Referenza spagnolo per le Salmonellosi registrò un aumento considerevole degli isolamenti di un sierotipo atipico di Salmonella enterica con formula antigenica [4,5,12:I:-].
Questo, dai 10 isolamenti dei 3 anni precedenti, passò nel secondo semestre del 1997 a rappresentare il quarto sierotipo per prevalenza tra quelli di origine umana e il nono tra quelli di origine alimentare, in particolare da carni suine (1,2).
Succesivamente, isolamenti del medesimo sierotipo si ebbero negli anni 1998 e 1999 anche negli Stati Uniti, dove, tra l'altro fu anche la causa di un episodio tossinfettivo nel distretto di New York City, caratterizzato da un alto tasso di ospedalizzazione e astensione dal lavoro, che coinvolse 110 persone durante una cena sociale (3).

Dalle analisi fenotipiche e genotipiche alle quali sono stati sottoposti negli anni successivi i ceppi di Salmonella [4,5,12:I:-] isolati nel corso degli anni 1998-1999, sono emerse alcune differenze tra i ceppi di origine spagnola e quelli di origine americana ferma restando la caratteristica di base comune dell'assenza della seconda fase flagellare H:2.
I ceppi spagnoli si sono dimostrati suscettibili alla lisi da parte del fago 10 e quindi sembrano appartenere al fagotipo U302 comune a S. Typhimurium e possiedono spesso un profilo di resistenza antibiotica comprendente 7 antibiotici (Amp, Clo, Str, Sul, Tet, Gm, Sxt).
I ceppi di origine americana appartengono invece a vari fagotipi e possiedono un profilo di antibiotico resistenza mancante del cloramfenicolo e della gentamicina. Dagli studi effettuati dal Laboratorio di Referenza spagnolo per le Salmonellosi sembra che la Salmonella monofasica sia una variante del sierotipo Typhimurium U302 [4,5,12:i:2] la cui diffusione è stata agevolata dalla spiccata antibiotico-resistenza che ha costituito un importante vantaggio selettivo (2).
Nel corso del 1998 Echeita et al.hanno messo a punto un saggio di PCR multiplex (4) al fine di aumentare la rapidità e l'affidabilità con cui si perviene al risultato di Salmonella [4,5,12:i:-]: infatti con le tecniche tradizionali di sierotipizzazione non è possibile discriminare con certezza tra Salmonella Typhimurium e Salmonella [4,5,12:I:-].

In Italia il sierotipo in questione ha subito un aumento significativo della frequenza soltanto a partire dal 2002. Nel corso dell'anno, infatti, il Centro di Riferimento Nazionale per le Salmonellosi dell'IZS delle Venezie ha riportato un aumento significativo della prevalenza assoluta, in particolare per quanto riguarda gli stipiti di origine suina, dove ha rappresentato il 6.81% di tutti gli stipiti isolati.
Nel corso del 2003 la prevalenza di isolamenti del nuovo sierotipo nei campioni di origine suina è ulterioremente aumentata, raggiungendo la percentuale del 10.37%.
La particolare diffusione del nuovo sierotipo nei campioni, sia animali che alimenatri di origine suina avvalora l'ipotesi che l'introduzione in Italia sia avvenuta attraverso l'importazione di suini dalla Spagna.
In campo umano la prevalenza del sierotipo in questione è stata per alcuni anni sottostimata, e probabilmente è stato confuso col sierotipo Typhimurium dal quale differisce soltanto per l'assenza della seconda fase flagellare.
Per tale motivo si presume che l'Istituto Superiore di Sanità, che si occupa della raccolta dei ceppi di origine umana dai laboratori periferici regionali, non ha registrato un aumento parallelo del sierotipo dal 2002.
Tuttavia, grazie a indagini a posteriori supportati da analisi del fagotipo, della resistenza antibiotica e del profilo risultante dalla PFGE, è possibile affermare che il sierotipo in questione è aumentato dal 2002 anche tra gli isolamenti umani.
L'aggiornamento più recente riguardante i dati del 2004 riporta una prevalenza molto significativa in campo umano. Difatti la Salmonella monofasica nel maggio 2004 si attestava in Italia al 3° posto in frequenza dopo Enteritidis e Typhimurium.
Inoltre il fagotipo prevalente è risultato U302 e il profilo di antibiotico-resistenza prevalente, costituito da 4 antibiotici: Amp, Str, Sul e Tet (ASSuT), è lo stesso riscontrato in ambito veterinario.

Materiali e metodi
Sono stati analizzati 72 ceppi di Salmonella, precedentemente identificati biochimicamente e sierotipizzati tramite agglutinazione su vetrino utilizzando sieri del commercio (Statens Serum Institut-Biogenetics Danimarca).
I 66 ceppi che tra questi erano di origine umana sono stati inviati presso il Centro di Riferimento Regionale per gli Enterobatteri dagli ospedali della regione mentre gli altri 6 di origine non umana (4 alimentari, uno ambientale e uno animale) provengono dalle altre sezioni dell'Istituto. Dei 72 ceppi in questione, 26 sono stati isolati nel 2003 e 46 nel 2004 fino al mese di settembre.
L'antibiogramma è stato eseguito secondo la tecnica della diffusione su dischetto seguendo le linee guida dell'NCCLS per l'interpretazione degli aloni di inibizione (5). Per i controlli di qualità sono stati impiegati ceppi inviati dal DFVF-Danish Institute for Food and Veterinary Research e ceppi di E. coli ATCC 25922.
Gli isolati sono stati piastrati su Muller-Hinton agar (Biolife, Milano, Italia) e per il test sono stati impiegati dischetti antibiotici del commercio (Oxoid, Hampshire, England e Mast Diagnostics, Merseyside, UK).
Per i ceppi umani sono stati saggiati 13 antibiotici alle seguenti concentrazioni: Ampicillina (A) 10, Cloramfenicolo (C) 30, Streptomicina (S) 10, Sulfonamidi (Su) 300, Tetraciclina (T) 30, Acido nalidixico (Nal) 30, Cefotaxime (Ctx) 30, Ciprofloxacina (Cip) 5, Gentamicina (Gm) 10, Kanamicina (Kan) 30, Amoxicillina-acido clavulanico (Amc) 30, Trimethoprim-Sulfametossazolo (Sxt) 1.25/23.75 e Cefalotina (Kf) 30.

Per i ceppi di origine non umana sono stati saggiati in aggiunta altri 3 antibiotici: Colistina (Cl) 10, Enrofloxacina (Enr) 5 e Neomicina (Neo) 30.
La fagotipizzazione è stata eseguita solo per i ceppi umani presso l'Istituto Superiore di Sanità impiegando metodiche standard (6) usando i fagi forniti dall' International Phage-typing Reference Laboratory (Health Protection Agency, London, UK).
Il saggio di PCR multiplex per la tipizzazione è stato eseguito secondo quanto riportato dagli autori spagnoli (4). Brevemente ogni ceppo batterico è stato sottoposto prima a lisi cellulare mediante bollitura e poi il sovranatante risultante dalla centrifigazione è stato impiegato per la PCR, la quale è basata sull'uso di 5 primers ed è stata eseguita in 50 ml di volume finale ad una temperatura di annealing di 56°C per 25 cicli.

Risultati
Il monitoraggio della Salmonella [4,5,12:I:-] nelle Marche è iniziato a partire dal 2003. Tutti i ceppi che, durante la sierotipizzazione, hanno fatto emergere il sospetto per Salmonella [4,5,12:I:-], sono stati inizialmente inviati al Centro di Referenza Nazionale di Legnaro che si è attivato sin dal 2001 per eseguire la PCR specifica, mentre lo stesso saggio è stato messo a punto anche presso il nostro Centro Regionale solo dal mese di agosto del corrente anno.
Più in dettaglio, dei 72 ceppi isolati, 62 sono stati sottoposti al saggio di PCRm eseguito presso il suddetto Centro di Riferimento Nazionale che ha confermato il sospetto per Salmonella [4,5,12:I:-] per 51 ceppi inviati mentre i restanti 11 appartenevano al sierotipo Typhimurium.
Tra i restanti 10 ceppi sospetti analizzati presso il nostro Centro Regionale, 9 erano Salmonella [4,5,12:I:-] e uno era S. Typhimurium.
Di seguito sono riportati i dati più salienti relativi ai 72 ceppi isolati nel 2003-2004.
Riguardo i 4 ceppi di origine alimentare isolati nel 2003 si può notare l'origine piuttosto varia poiché 2 ceppi sono stati isolati da carni suine lavorate, uno da carne bovina fresca e uno da vongole di mare.
Nel 2004 è stato isolato un ceppo di origine ambientale proveniente da acque fluviali superficiali. Infine è stato isolato un solo ceppo di origine animale proveniente da un campione di feci di suino.
Riguardo i 66 ceppi di origine umana la distribuzione per fasce d'età è la seguente: 2 ceppi sono stati isolati da neonati di età inferiore ad un anno, 30 ceppi derivano da bambini appartenenti alla fascia d'età 1-5, 15 appartengono alla fascia in età scolare (6-14), 10 derivano da adulti (16-64) e infine 9 sono stati isolati da persone anziane (più di 65 anni).
Riguardo il fagotipo la situazione regionale risulta pressochè sovrapponibile a quella nazionale in quanto il fagotipo prevalente è U302 (27%) seguito a poca distanza dal fagotipo NT (24%).

Riguardo la resistenza antibiotica bisogna innanzitutto sottolineare la notevole uniformità dei profili di resistenza soprattutto in confronto con i dati ottenuti dal gruppo americano (3).
Inoltre, se si considerano "multiresistenti" i ceppi che presentano un numero uguale o superriore a 4 resistenze, la percentuale risulta pari a 93% (con solo 5 ceppi sensibili) che è molto elevata se confrontata con la percentuale media di multiresistenza per tutti i sierotipi registrata nella regione nel 2003 (59%).
Più in dettaglio, il 61% dei ceppi presenta un nucleo centrale composto da 4 antibiotici (ASSuT), il 21% presenta un nucleo centrale di 5 antibiotici (ACSSuT) e in aggiunta a questi si sono registrate le seguenti resistenze ai singoli farmaci: Sxt (44.3%) Gm (23.4%), Nal (20.1%), Kf (9.3%) e Kan (6.5%).

Discussione
E' interessante aggiungere notizie ulteriori riguardo a 16 ceppi pervenuti al Centro tra Aprile e Maggio 2004 provenienti dall'Azienda Ospedaliera San Salvatore di Pesaro.
Infatti tali ceppi provengono da alcuni soggetti portatori sani coinvolti in un'inchiesta epidemiologica eseguita in seguito al verificarsi di un solo caso di infezione.
Questa indagine si è estesa a numerosi bambini frequentanti le scuole e gli asili di Pesaro e loro familiari. I Servizi Sanitari competenti hanno svolto le indagini includendo anche il centro cottura esterno che fornisce i pasti alle mense scolastiche, ma purtroppo i dati raccolti non hanno permesso di risalire alla fonte di contagio. Si tratta comunque di ceppi notevolmente resistenti agli antibiotici inclusi cloramfenicolo e acido nalidixico per i quali esiste una sorveglianza particolarmente attenta in quanto costituiscono farmaci di ultima generazione e/o marcatori epidemiologici.

Inoltre è interessante notare che, se si escludono i suddetti ceppi che sono in maggioranza portatori sani, il tasso di ospedalizzazione risulta più alto della media del 2003 registrata nelle Marche per tutti i sierotipi: infatti essa è pari al 50% contro la media del 36%.
Il Centro di Referenza Nazionale di Legnaro ha pubblicato alcuni dati relativi a 80 stipiti isolati nel triennio nazionale nel periodo 2000-2003 per lo più di origine veterinaria (7).
Rispetto a questi ultimi, dai nostri dati emergono alcune importanti differenze riguardo due antibiotici. Infatti dall'analisi dei dati del presente lavoro emerge una percentuale di resistenza alla gentamicina del 23.4% più elevata di quella pubblicata dal gruppo di Legnaro (12.7%) e molto più elevata rispetto alla media nazionale (2.5%). Lo tesso discorso vale per l'acido nalidixico che in questo lavoro presenta un livello di resistenza pari al 20.1% contro il dato riportato dal gruppo di Legnaro pari al 2.5%.

Si può ipotizzare pertanto una tendenza maggiore allo sviluppo di resistenza negli stipiti di origine umana rispetto a quelli di origine veterinaria che senz'altro meriterebbe di essere approfondita e tenuta sotto controllo.

Bibliografia:
1. Echeita MA, Aladuena A, Cruchaga S et al.1999 Emergence and Spread of an Atypical Salmonella enterica subsp.enterica Serotype [4,5,12:I:-] Strain in Spain. J of Clin Microbiol 37 (10): 3425.

2. Echeita MA, Herrera S, Usera MA. 2001 Atiypical fljB-negative Salmonella enterica subsp. enterica Strain of Serovar [4,5,12:I:-] Appears to Be a Monophasic Variant of Serovar Typhimurium. J of Clin Microbiol 39 (8): 2981-3.

3. Agasan A, Kornblum J, Williams G et al. 2002 Profile of Salmonella enterica subsp. enterica (subspecies I) serotype [4,5,12:I:-] strains causing food-borne infections in New York City. J Clin Microbiol 40 (6): 1924-9.

4. Echeita MAS and Usera MA. 1998 Rapid identification of Salmonella spp. Phase 2 antigens of the H1 antigenic complex using "multiplex PCR". Res Microbiol 149: 757-61.

5. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2000 7th ed., M2-A7. 6. Anderson ES, Ward LR, Saxe MJ, de Sa JD. 1997 Bacterio-phage-typing designations of Salmonella Typhimurium. J Hyg; 78: 297-300.

7. Atti del V Congresso Nazionale SIDiLV, Pisa, 20-21 Novembre 2003, 205-206.



Tasto SU


torna all'indice generale della Webzine


torna indietro

logo IZS-UM